6.2 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC)

6.2.1 Chromatografické podmínky
— Mobilní fáze: směs tetrahydrofuran/voda/methanol/acetonitril (4.17)
— Průtoková rychlost: 1,5 ml/min
— Detekční vlnová délka: 280 nm

6.2.2 Kalibrace
Nastříkne se 10 μl každého ze standardních roztoků konzervantů (4.19). Ze získaných chromatogramů se stanoví poměr výšek píků standardních roztoků konzervantů k píku vnitřního standardu. Pro každý konzervant se sestrojí křivka závislosti těchto poměrů na koncentraci standardních roztoků.

6.2.3 Stanovení
Do chromatogafu se nastříkne 10 μl roztoku vzorku bez vnitřního standardu (6.1.1) a zaznamená se chromatogram.
Nastříkne se 10 μl jednoho ze standardních roztoků konzervantů (4.19) a zaznamená se chromatogram. Získané chromatogramy se porovnají.
Není-li v chromatogramu extraktu vzorku (6.1.1) přítomen pík s přibližně stejným retenčním časem, jako je retenční čas píku isopropylparabenu (doporučený vnitřní standard), pokračuje se nastříknutím 10 μl roztoku vzorku s vnitřním standardem (6.1.2). Chromatogram se zaznamená a změří se výšky píků.
Je-li v chromatogramu roztoku vzorku rušivý pík s retenčním časem přibližně stejným jako retenční čas isopropylparabenu, měl by být vybrán jiný vnitřní standard.
Není-li jeden z vyšetřovaných konzervantů v chromatogramu vzorku přítomen, lze tento konzervant použít jako vnitřní standard.
Vypočítají se poměry výšek píků vyšetřovaných konzervantů k výšce píku vnitřního standardu.
Je třeba ověřit, že kalibrační křivka použitého standardu je lineární.
Je třeba ověřit, zda chromatogramy získané pro standardní roztok a roztok vzorku splňují následující požadavky:
— separace píků nejhůře odděleného páru je alespoň 0,90. (Definice separace píků je uveden na obrázku 16.)

Obrázek 16: Separace píků
Není-li požadované separace dosaženo, měla by být buď použita účinnější kolona, nebo by mělo být složení mobilní fáze upraveno tak, aby byl požadavek splněn.
— faktor asymetrie (As) všech získaných píků by se měl pohybovat od 0,9 do 1,5. (Definice faktoru asymetrie je uvedena na obrázku 17.) Při zaznamenání chromatogramu za účelem stanovení faktoru asymetrie je doporučená rychlost zaznamenávání 2 cm/min.

17: Faktor asymetrie píku
— Základna by měla být stabilní.