3. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE
Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší
3.1 Ethanol, bezvodý
3.2 Aceton
3.3 Ethanol, 96 % (V/V)
3.4 Roztok amoniaku, 25 %
3.5 L-(+)-askorbová kyselina
3.6 Chloroform
3.7 Cyklohexan
3.8 Dusík, technický
3.9 Toluen
3.10 Benzen
3.11 Butan-1-ol
3.12 Butan-2-ol
3.13 Kyselina fosforná, 50% roztok (V/V)
3.14 Diazotační činidlo. Buď:
— 3-nitro-1-benzendiazonium-chlorbenzensulfonát (ve formě stabilní soli), jako např. v červeni 2 JN - Francolor,
— 2-chlor-4-nitro-1-benzendiazonium-naftalenbenzoát (ve formě stabilní soli), jako např. v činidle NNCD - referenční č. 74 150 FLUKA,
nebo ekvivalentní.
3.15 Dusičnan stříbrný
3.16 p-dimethylaminobenzaldehyd
3.17 2,5-dimethylfenol
3.18 Chlorid železitý, hexahydrát
3.19 Kyselina chlorovodíková, 10% roztok (m/V)
3.20 Standardy
Standardy jsou sloučeniny uvedené v oddíle 1 „Rozsah a oblast použití“. V případě aminosloučenin musí být standardní sloučenina buď ve formě hydrochloridu (mono nebo di), nebo jako volná báze.
3.21 Standardní roztoky 0,5 % (m/V)
Připraví se 0,5% roztoky (m/V) standardů uvedených v bodě 3.20.
Naváží se 50 ± 1 mg standardu do odměrné baňky na 10 ml.
Přidá se 5 ml 96% ethanolu (3.3) a 250 ml kyseliny askorbové (3.5).
Roztok se alkalizuje přidáním roztoku amoniaku (3.4) na hodnotu pH 10 (zjišťuje se indikátorovým papírkem).
Doplní se na 10 ml 96 % ethanolem (3.3) a promíchá.
Roztoky je možno uchovávat po dobu jednoho týdne v chladu a temnu.
V některých případech může po přidání askorbové kyseliny a roztoku amoniaku vzniknout sraženina. Před dalším postupem je třeba ji nechat usadit.
3.22 mobilní fáze
3.22.1 Aceton ‒ chloroform ‒ toluen (35:25:40, V/V/V)
3.22.2 Chloroform ‒ cyklohexan ‒ ethanol ‒ 25% roztok amoniaku (80:10:10:1, V/V/V/V)
3.22.3 Benzen ‒ butan-2-ol ‒ voda (50:25:25, V/V/V). Důkladně se protřepe a po dekantaci při pokojové teplotě (20 až 25 °C) se k vyvíjení použije horní fáze.
3.22.4 n-butanol ‒ chloroform ‒ činidlo M (7:70:23, V/V/V). Fáze se pečlivě dekantují při pokojové teplotě (20 až 25 °C) a použije se spodní fáze.
Příprava činidla M
| Roztok amoniaku, 25 % (V/V) | 24 objemových jednotek |
| Kyselina fosforná, 50 % (3.13) | 1 objemová jednotka |
| Voda | 75 objemových jednotek |
Poznámka:
Mobilní fáze obsahující amoniak je třeba bezprostředně před použitím dobře protřepat.
3.23 Detekční činidla
3.23.1 Diazotační činidlo
Připraví se 5% (m/V) vodný roztok zvoleného činidla (3.14). Tento roztok se musí připravit bezprostředně před použitím.
3.23.2 Ehrlichovo činidlo
2 g p-dimethylaminobenzaldehydu (3.16) se rozpustí ve 100 ml 10% vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové (m/V) (3.19).
3.23.3 2,5-dimethylfenol – hexahydrát chloridu železitého
Roztok 1: Rozpustí se 1 g dimethylfenolu (3.17) ve 100 ml 96% ethanolu (3.3).
Roztok 2: Rozpustí se 4 g hexahydrátu chloridu železitého (3.18) ve 100 ml 96% ethanolu (3.3).
Při vyvolání chromatogramu se těmito roztoky provádí postřik samostatně, nejprve roztokem 1, poté roztokem 2.
3.23.4 Amoniakální dusičnan stříbrný
25% amoniak (3.4) se přidává k 5% (m/V) vodnému roztoku dusičnanu stříbrného (3.15), až se sraženina právě rozpustí. Toto reakční činidlo se připravuje bezprostředně před použitím. Nelze jej uchovávat.