9. KVALITATIVNÍ A SEMIKVANTITATIVNÍ STANOVENÍ URČITÝCH OXIDAČNÍCH BARVIV V BARVÁCH NA VLASY
1. ROZSAH A OBLAST POUŽITÍ
Tato metoda je vhodná pro kvalitativní a semikvantitativní stanovení následujících látek v barvách na vlasy ve formě krému nebo kapaliny:
| Látky | Symbol |
| Fenylendiaminy | |
| o-fenylendiamin | (OPD) |
| m-fenylendiamin | (MPD) |
| p-fenylendiamin | (PPD) |
| Methylfenylendiaminy | |
| 4-methyl-1,2-fenylendiamin (toluen-3,4-diamin) | (OTD) |
| 4-methyl-1,3-fenylendiamin (toluen-2,4-diamin) | (MTD) |
| 2-methyl-1,4-fenylendiamin (toluen-2,5-diamin) | (PTD) |
| Diaminofenoly | |
| 2,4-diaminofenol | (DAP) |
| Hydrochinon | |
| Benzen-1,4-diol | (H) |
| α-naftol | (α-N) |
| Pyrogallol | |
| Benzen-1,2,3-triol | (P) |
| Resorcinol | |
| Benzen-1,3-diol | (R) |
2. PRINCIP
Oxidační barviva se extrahují z barev ve formě krému nebo kapaliny při pH 10 96% ethanolem a identifikují se jedno- nebo dvourozměrnou chromatografií na tenké vrstvě.
K semikvantitativnímu stanovení těchto látek se chromatogram vzorků porovná pomocí čtyř vyvíjecích systémů s chromatogramy referenčních látek vyvíjenými současně a za co nejpodobnějších podmínek.
3. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE
Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší
3.1 Ethanol, bezvodý
3.2 Aceton
3.3 Ethanol, 96 % (V/V)
3.4 Roztok amoniaku, 25 %
3.5 L-(+)-askorbová kyselina
3.6 Chloroform
3.7 Cyklohexan
3.8 Dusík, technický
3.9 Toluen
3.10 Benzen
3.11 Butan-1-ol
3.12 Butan-2-ol
3.13 Kyselina fosforná, 50% roztok (V/V)
3.14 Diazotační činidlo. Buď:
— 3-nitro-1-benzendiazonium-chlorbenzensulfonát (ve formě stabilní soli), jako např. v červeni 2 JN - Francolor,
— 2-chlor-4-nitro-1-benzendiazonium-naftalenbenzoát (ve formě stabilní soli), jako např. v činidle NNCD - referenční č. 74 150 FLUKA,
nebo ekvivalentní.
3.15 Dusičnan stříbrný
3.16 p-dimethylaminobenzaldehyd
3.17 2,5-dimethylfenol
3.18 Chlorid železitý, hexahydrát
3.19 Kyselina chlorovodíková, 10% roztok (m/V)
3.20 Standardy
Standardy jsou sloučeniny uvedené v oddíle 1 „Rozsah a oblast použití“. V případě aminosloučenin musí být standardní sloučenina buď ve formě hydrochloridu (mono nebo di), nebo jako volná báze.
3.21 Standardní roztoky 0,5 % (m/V)
Připraví se 0,5% roztoky (m/V) standardů uvedených v bodě 3.20.
Naváží se 50 ± 1 mg standardu do odměrné baňky na 10 ml.
Přidá se 5 ml 96% ethanolu (3.3) a 250 ml kyseliny askorbové (3.5).
Roztok se alkalizuje přidáním roztoku amoniaku (3.4) na hodnotu pH 10 (zjišťuje se indikátorovým papírkem).
Doplní se na 10 ml 96 % ethanolem (3.3) a promíchá.
Roztoky je možno uchovávat po dobu jednoho týdne v chladu a temnu.
V některých případech může po přidání askorbové kyseliny a roztoku amoniaku vzniknout sraženina. Před dalším postupem je třeba ji nechat usadit.
3.22 mobilní fáze
3.22.1 Aceton ‒ chloroform ‒ toluen (35:25:40, V/V/V)
3.22.2 Chloroform ‒ cyklohexan ‒ ethanol ‒ 25% roztok amoniaku (80:10:10:1, V/V/V/V)
3.22.3 Benzen ‒ butan-2-ol ‒ voda (50:25:25, V/V/V). Důkladně se protřepe a po dekantaci při pokojové teplotě (20 až 25 °C) se k vyvíjení použije horní fáze.
3.22.4 n-butanol ‒ chloroform ‒ činidlo M (7:70:23, V/V/V). Fáze se pečlivě dekantují při pokojové teplotě (20 až 25 °C) a použije se spodní fáze.
Příprava činidla M
| Roztok amoniaku, 25 % (V/V) | 24 objemových jednotek |
| Kyselina fosforná, 50 % (3.13) | 1 objemová jednotka |
| Voda | 75 objemových jednotek |
Poznámka:
Mobilní fáze obsahující amoniak je třeba bezprostředně před použitím dobře protřepat.
3.23 Detekční činidla
3.23.1 Diazotační činidlo
Připraví se 5% (m/V) vodný roztok zvoleného činidla (3.14). Tento roztok se musí připravit bezprostředně před použitím.
3.23.2 Ehrlichovo činidlo
2 g p-dimethylaminobenzaldehydu (3.16) se rozpustí ve 100 ml 10% vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové (m/V) (3.19).
3.23.3 2,5-dimethylfenol – hexahydrát chloridu železitého
Roztok 1: Rozpustí se 1 g dimethylfenolu (3.17) ve 100 ml 96% ethanolu (3.3).
Roztok 2: Rozpustí se 4 g hexahydrátu chloridu železitého (3.18) ve 100 ml 96% ethanolu (3.3).
Při vyvolání chromatogramu se těmito roztoky provádí postřik samostatně, nejprve roztokem 1, poté roztokem 2.
3.23.4 Amoniakální dusičnan stříbrný
25% amoniak (3.4) se přidává k 5% (m/V) vodnému roztoku dusičnanu stříbrného (3.15), až se sraženina právě rozpustí. Toto reakční činidlo se připravuje bezprostředně před použitím. Nelze jej uchovávat.
4. PŘÍSTROJE A POMŮCKY
4.1 Obvyklé laboratorní vybavení pro chromatografii na tenké vrstvě.
4.1.1 Plastový nebo skleněný kryt konstruovaný tak, aby chromatografickou desku během nanášení skvrn a sušení mohl obtékat dusík. Toto opatření je nezbytné vzhledem k náchylnosti určitých barviv k oxidaci.
4.1.2 Mikrostříkačka na 10 μl, dělená po 0,2 μl, s jehlou s rovným koncem, nebo lépe dávkovač na 50 μl uchycený v držáku tak, aby deska mohla být udržována pod atmosférou dusíku.
4.1.3 Hotové silikagelové desky, tloušťka 0,25 mm, rozměry 20 x 20 cm (Macherey and Nagel, Silica G-HR, na plastové podložce, nebo ekvivalentní).
4.2 Odstředivka, 4000 ot./min.
4.3 Centrifugační zkumavky na 10 ml se šroubovacími uzávěry potaženými PTFE nebo ekvivalentní.
5. POSTUP
TABULKA 1
Hodnoty Rf a barvy získané bezprostředně po vyvolání
| Standard (3.20) | Mobilní fáze | Mobilní fáze | ||||||
| Hodnoty Rf | Výsledné barvy | |||||||
| (3.22.1) | (3.22.2) | (3.22.3) | (3.22.4) | Diazo (3.23.1) | Ehrlich (3.23.2) | Dimethyl-fenol (3.23.3) | AgNO3 (3.23.4) | |
| OPD | 0,62 | 0,60 | 0,30 | 0,57 | světle hnědá | — | — | světle hnědá |
| MPD | 0,40 | 0,60 | 0,47 | 0,48 | fialově hnědá (*) | žlutá | světle hnědá | světle hnědá |
| PPD | 0,20 | 0,50 | 0,30 | 0,48 | hnědá | jasně červená (*) | fialová | šedá |
| OTD | 0,60 | 0,60 | 0,53 | 0,60 | hnědá (*) | světle oranžová | světle hnědá | šedavě hnědá |
| MTD | 0,40 | 0,67 | 0,45 | 0,60 | červenavě hnědá (*) | žlutá | hnědá | černá |
| PTD | 0,33 | 0,65 | 0,37 | 0,70 | hnědá | oranžová | fialová (*) | šedá |
| DAP | 0,07 | — | 0 | 0,05 | hnědá (*) | oranžová | fialová | hnědá |
| H | 0,50 | 0,35 | 0,80 | 0,20 | — | oranžová | fialová | černá (*) |
| α-N | 0,90 | 0,80 | 0,90 | 0,75 | oranžově hnědá | — | fialová (*) | černá |
| P | 0,37 | — | 0,67 | 0,05 | hnědá | velmi světle fialová | velmi světle hnědá | hnědá (*) |
| R | 0,50 | 0,37 | 0,80 | 0,17 | oranžová (*) | světle fialová | velmi světle hnědá | světle hnědá |
Poznámka
5.1 Příprava vzorků k analýze
První 2 až 3 cm krému vytlačeného z tuby se odstraní.
Do centrifugační zkumavky (4.3) předem propláchnuté dusíkem se převede: 300 mg kyseliny askorbové se 3 g krému nebo 3 g homogenizované kapaliny.
Přidává se po kapkách 25 % amoniak (3.4) až pH dosáhne hodnoty 10. Doplní se na 10 ml 96 % ethanolem (3.3).
Homogenizuje se pod atmosférou dusíku (3.8), zazátkuje se a centrifuguje se po 10 minut při 4000 ot./min.
Použije se supernatant.
1. OPD se ukazuje pouze slabě; musí se použít rozpouštědlo (3.22.3), aby se jasně odlišil od OTD.
5.2 Chromatografie
5.2.1 Nanášení na desku
Pod atmosférou dusíku (3.8) se na chromatografickou desku (4.1.3) nanese po 1 μl každé shora uvedené referenční látky v devíti bodech vzdálených od sebe 1,5 cm podél linie vzdálené asi 1,5 cm od okraje desky.
Referenční látky se nanášejí v tomto uspořádání:
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
| R | P | H | PPD | DAP | PTD | OPD | OTD | MPD |
| MTD | α-N | |||||||
Dále se v bodech 10 a 11 nanesou vždy 2 μl zkoumaných roztoků získaných podle bodu 5.1.
Deska se uchovává pod atmosférou dusíku (3.8) až do okamžiku, kdy je zahájeno vyvíjení chromatogramu.
5.2.2 Vyvíjení
Deska se vloží do komory předem propláchnuté dusíkem (3.8) a nasycené jedním ze čtyř rozpouštědel (3.22) a nechá se vyvíjet při laboratorní teplotě (20 až 25 °C) ve tmě, dokud čelo rozpouštědla nedosáhne vzdálenosti asi 15 cm od startovací linie.
Deska se vyjme a usuší pod atmosférou dusíku (3.8) při laboratorní teplotě.
5.2.3 Vyvolání
Deska se postříká odpovídajícím detekčním činidlem uvedeným v bodě 3.23.
5.2.4 Kvalitativní stanovení
Porovnají se hodnoty Rf a barvy skvrn vzorku a chromatografovaných referenčních látek.
V tabulce 1 jsou uvedeny příklady hodnot Rf a barev skvrn pro jednotlivé látky v závislosti na použitém rozpouštědle a indikátoru.
Nejistý důkaz je někdy možno potvrdit metodou standardního přípravku.
5.2.5 Semikvantitativní odhad
Intenzita skvrn jednotlivých látek identifikovaných v bodě 5.2.4 se porovnává vizuálně s odpovídajícím rozsahem koncentrací standardních látek.
Při nadměrně vysoké koncentraci jedné nebo více látek nalezených ve vzorku se extrakt vzorku zředí a měření se opakuje.
2. (*) Označuje nejlépe vyvolané barvy.
6. ZKOUŠKA DVOUROZMĚRNOU CHROMATOGRAFIÍ NA TENKÉ VRSTVĚ
Tato metoda dvourozměrné chromatografie vyžaduje použití dalších standardů a reakčních činidel.
Tabulka II
Barvy skvrn standardů po chromatografii a vyvíjení parami jodu
| Standardy | Barvy po vyvíjení parami jodu |
| R | béžová |
| P | hnědá |
| α-N | fialová |
| β-N | světle hnědá |
| H | fialově hnědá |
| MPD | žlutavě hnědá |
| PPD | fialově hnědá |
| MTD | tmavě hnědá |
| PTD | žlutavě hnědá |
| DAP | tmavě hnědá |
| OAP | oranžová |
| MAP | žlutavě hnědá |
| PAP | fialově hnědá |
| 2-NPPD | hnědá |
| 4-NOPD | oranžová |
Obrázek 6
6.1 Další standardy a činidla
6.1.1 β-naftol (β-N)
6.1.2 2-aminofenol (OAP)
6.1.3 3-aminofenol (MAP)
6.1.4 4-aminofenol (PAP)
6.1.5 2-nitro-1,4-fenylendiamin (2-NPPD)
6.1.6 4-nitro-1,2-fenylendiamin (4-NOPD)
Připraví se 0,5 % (m/V) roztoky všech dalších standardů způsobem popsaným v bodě 3.21.
6.2 Další mobilní fáze
6.2.1 Ethylacetát – cyklohexan – 25 % roztok amoniaku (65:30:0,5, V/V/V)
6.3 Další detekční systém
Do vyvíjecí komory pro chromatografii na tenké vrstvě se vloží skleněná nádobka, přidají se asi 2 g krystalického jodu a komora se uzavře odpovídajícím víkem.
6.4 Chromatografie
6.4.1 Podle obrázku 6 se na desce pro chromatografii na tenké vrstvě (4.1.3) vyznačí na straně s adsorbentem dvě linky.
6.4.2 V dusíkové atmosféře (4.1.1) se nanese 1 až 4 μl extraktu (5.1) do základního bodu 1 (obr. 6), který leží asi 2 cm od obou okrajů. Množství extraktu závisí na intenzitě skvrn na chromatogramech podle bodu 5.2.
6.4.3 Mezi body 2 a 3 (obr. 6) se nanesou oxidační barviva identifikovaná nebo pokládaná za identifikovaná podle bodu 5.2 (vzdálenost mezi body je 1,5 cm). Nanáší se 2 μl každého referenčního roztoku – kromě DAP, který je nutno nanést v objemu 6 μl. Nanášení se provádí v atmosféře dusíku (6.4.2).
6.4.4 Postup podle bodu 6.4.3 se opakuje v základních bodech 4 a 5 (obr. 6) a deska se uchovává pod dusíkem až do zahájení vyvolávání chromatogramu (vzdálenost mezi body je 1,5 cm).
6.4.5 Chromatografická komora se propláchne dusíkem (3.8) a umístí se do ní vhodné množství mobilní fáze 3.22.2. Deska (6.4.4) se vloží do komory a vyvíjí se ve tmě v prvním vyvíjecím směru (obr. 6).
Vyvíjí se, dokud čelo rozpouštědla nedosáhne linie vyznačené na desce (přibližně 13 cm).
6.4.6 Deska se z komory vyjme a umístí do jiného chromatografické komory, předem propláchnuté dusíkem, aby se vyvíjecí rozpouštědlo odpařovalo alespoň 60 minut.
6.4.7 Pomocí dělené zkumavky se do komory předem propláchnuté dusíkem (3.8) vnese vhodné množství mobilní fáze (6.2), do komory se vloží deska otočená o 90° (6.4.6) a chromatogram se vyvíjí ve druhém směru (opět ve tmě), dokud čelo rozpouštědla nedosáhne linie vyznačené na straně s adsorbentem. Deska se vyjme z komory a rozpouštědlo se nechá odpařit na vzduchu.
6.4.8 Deska se na 10 minut umístí do chromatografické komory obsahující páry jodu (6.3) a dvourozměrný chromatogram se interpretuje s využitím hodnot Rf a barev současně chromatografovaných standardů (hodnoty Rf a barvy skvrn jsou uvedeny v tabulce II).
Poznámka
Nejlepšího vybarvení skvrn se dosáhne tehdy, ponechá-li se po vyvíjení chromatogram v atmosféře par jódu po dobu půl hodiny.
6.4.9 Přítomnost oxidačních barviv nalezených podle bodu 6.4.8 je možno definitivně potvrdit opakováním postupu popsaného v bodech 6.4.1 až 6.4.8, kdy se v základním bodě 1 přes množství extraktu podle bodu 6.4.2 nanese 1 μl referenčních látek identifikovaných v bodu 6.4.8. Neobjeví-li se oproti chromatogramu získaného podle bodu 6.4.8 žádná jiná skvrna, je interpretace chromatogramu podle bodu 6.4.8 správná.