6.4 Chromatografie

6.4.1 Podle obrázku 6 se na desce pro chromatografii na tenké vrstvě (4.1.3) vyznačí na straně s adsorbentem dvě linky.

6.4.2 V dusíkové atmosféře (4.1.1) se nanese 1 až 4 μl extraktu (5.1) do základního bodu 1 (obr. 6), který leží asi 2 cm od obou okrajů. Množství extraktu závisí na intenzitě skvrn na chromatogramech podle bodu 5.2.

6.4.3 Mezi body 2 a 3 (obr. 6) se nanesou oxidační barviva identifikovaná nebo pokládaná za identifikovaná podle bodu 5.2 (vzdálenost mezi body je 1,5 cm). Nanáší se 2 μl každého referenčního roztoku – kromě DAP, který je nutno nanést v objemu 6 μl. Nanášení se provádí v atmosféře dusíku (6.4.2).

6.4.4 Postup podle bodu 6.4.3 se opakuje v základních bodech 4 a 5 (obr. 6) a deska se uchovává pod dusíkem až do zahájení vyvolávání chromatogramu (vzdálenost mezi body je 1,5 cm).

6.4.5 Chromatografická komora se propláchne dusíkem (3.8) a umístí se do ní vhodné množství mobilní fáze 3.22.2. Deska (6.4.4) se vloží do komory a vyvíjí se ve tmě v prvním vyvíjecím směru (obr. 6).
Vyvíjí se, dokud čelo rozpouštědla nedosáhne linie vyznačené na desce (přibližně 13 cm).

6.4.6 Deska se z komory vyjme a umístí do jiného chromatografické komory, předem propláchnuté dusíkem, aby se vyvíjecí rozpouštědlo odpařovalo alespoň 60 minut.

6.4.7 Pomocí dělené zkumavky se do komory předem propláchnuté dusíkem (3.8) vnese vhodné množství mobilní fáze (6.2), do komory se vloží deska otočená o 90° (6.4.6) a chromatogram se vyvíjí ve druhém směru (opět ve tmě), dokud čelo rozpouštědla nedosáhne linie vyznačené na straně s adsorbentem. Deska se vyjme z komory a rozpouštědlo se nechá odpařit na vzduchu.

6.4.8 Deska se na 10 minut umístí do chromatografické komory obsahující páry jodu (6.3) a dvourozměrný chromatogram se interpretuje s využitím hodnot R_f a barev současně chromatografovaných standardů (hodnoty R_f a barvy skvrn jsou uvedeny v tabulce II).
Poznámka
Nejlepšího vybarvení skvrn se dosáhne tehdy, ponechá-li se po vyvíjení chromatogram v atmosféře par jódu po dobu půl hodiny.

6.4.9 Přítomnost oxidačních barviv nalezených podle bodu 6.4.8 je možno definitivně potvrdit opakováním postupu popsaného v bodech 6.4.1 až 6.4.8, kdy se v základním bodě 1 přes množství extraktu podle bodu 6.4.2 nanese 1 μl referenčních látek identifikovaných v bodu 6.4.8. Neobjeví-li se oproti chromatogramu získaného podle bodu 6.4.8 žádná jiná skvrna, je interpretace chromatogramu podle bodu 6.4.8 správná.