5. POSTUP
TABULKA 1
Hodnoty Rf a barvy získané bezprostředně po vyvolání
| Standard (3.20) | Mobilní fáze | Mobilní fáze | ||||||
| Hodnoty Rf | Výsledné barvy | |||||||
| (3.22.1) | (3.22.2) | (3.22.3) | (3.22.4) | Diazo (3.23.1) | Ehrlich (3.23.2) | Dimethyl-fenol (3.23.3) | AgNO3 (3.23.4) | |
| OPD | 0,62 | 0,60 | 0,30 | 0,57 | světle hnědá | — | — | světle hnědá |
| MPD | 0,40 | 0,60 | 0,47 | 0,48 | fialově hnědá (*) | žlutá | světle hnědá | světle hnědá |
| PPD | 0,20 | 0,50 | 0,30 | 0,48 | hnědá | jasně červená (*) | fialová | šedá |
| OTD | 0,60 | 0,60 | 0,53 | 0,60 | hnědá (*) | světle oranžová | světle hnědá | šedavě hnědá |
| MTD | 0,40 | 0,67 | 0,45 | 0,60 | červenavě hnědá (*) | žlutá | hnědá | černá |
| PTD | 0,33 | 0,65 | 0,37 | 0,70 | hnědá | oranžová | fialová (*) | šedá |
| DAP | 0,07 | — | 0 | 0,05 | hnědá (*) | oranžová | fialová | hnědá |
| H | 0,50 | 0,35 | 0,80 | 0,20 | — | oranžová | fialová | černá (*) |
| α-N | 0,90 | 0,80 | 0,90 | 0,75 | oranžově hnědá | — | fialová (*) | černá |
| P | 0,37 | — | 0,67 | 0,05 | hnědá | velmi světle fialová | velmi světle hnědá | hnědá (*) |
| R | 0,50 | 0,37 | 0,80 | 0,17 | oranžová (*) | světle fialová | velmi světle hnědá | světle hnědá |
Poznámka
5.1 Příprava vzorků k analýze
První 2 až 3 cm krému vytlačeného z tuby se odstraní.
Do centrifugační zkumavky (4.3) předem propláchnuté dusíkem se převede: 300 mg kyseliny askorbové se 3 g krému nebo 3 g homogenizované kapaliny.
Přidává se po kapkách 25 % amoniak (3.4) až pH dosáhne hodnoty 10. Doplní se na 10 ml 96 % ethanolem (3.3).
Homogenizuje se pod atmosférou dusíku (3.8), zazátkuje se a centrifuguje se po 10 minut při 4000 ot./min.
Použije se supernatant.
1. OPD se ukazuje pouze slabě; musí se použít rozpouštědlo (3.22.3), aby se jasně odlišil od OTD.
5.2 Chromatografie
5.2.1 Nanášení na desku
Pod atmosférou dusíku (3.8) se na chromatografickou desku (4.1.3) nanese po 1 μl každé shora uvedené referenční látky v devíti bodech vzdálených od sebe 1,5 cm podél linie vzdálené asi 1,5 cm od okraje desky.
Referenční látky se nanášejí v tomto uspořádání:
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
| R | P | H | PPD | DAP | PTD | OPD | OTD | MPD |
| MTD | α-N | |||||||
Dále se v bodech 10 a 11 nanesou vždy 2 μl zkoumaných roztoků získaných podle bodu 5.1.
Deska se uchovává pod atmosférou dusíku (3.8) až do okamžiku, kdy je zahájeno vyvíjení chromatogramu.
5.2.2 Vyvíjení
Deska se vloží do komory předem propláchnuté dusíkem (3.8) a nasycené jedním ze čtyř rozpouštědel (3.22) a nechá se vyvíjet při laboratorní teplotě (20 až 25 °C) ve tmě, dokud čelo rozpouštědla nedosáhne vzdálenosti asi 15 cm od startovací linie.
Deska se vyjme a usuší pod atmosférou dusíku (3.8) při laboratorní teplotě.
5.2.3 Vyvolání
Deska se postříká odpovídajícím detekčním činidlem uvedeným v bodě 3.23.
5.2.4 Kvalitativní stanovení
Porovnají se hodnoty Rf a barvy skvrn vzorku a chromatografovaných referenčních látek.
V tabulce 1 jsou uvedeny příklady hodnot Rf a barev skvrn pro jednotlivé látky v závislosti na použitém rozpouštědle a indikátoru.
Nejistý důkaz je někdy možno potvrdit metodou standardního přípravku.
5.2.5 Semikvantitativní odhad
Intenzita skvrn jednotlivých látek identifikovaných v bodě 5.2.4 se porovnává vizuálně s odpovídajícím rozsahem koncentrací standardních látek.
Při nadměrně vysoké koncentraci jedné nebo více látek nalezených ve vzorku se extrakt vzorku zředí a měření se opakuje.
2. (*) Označuje nejlépe vyvolané barvy.