1. 6. 3 Metoda HPLC

1. 6. 3. 1 Příprava
Aparatura
Je zapotřebí kapalinový chromatograf, vybavený bezpulzním čerpadlem a vhodným detekčním zařízením. Doporučuje se používat vstřikovací ventil se vstřikovacími smyčkami. Přítomnost polárních skupin ve stacionární fázi může závažně znehodnotit funkci kolony HPLC. Proto musí mít stacionární fáze minimální podíl polárních skupin (11). Je možné používat komerční mikročásticové náplně s reverzními fázemi nebo hotové kolony s náplní. Mezi vstřikovacím systémem a analytickou kolonou musí být umístěna ochranná předkolona.
Mobilní fáze
K přípravě elučního rozpouštědla se používají metanol čistoty pro HPLC a voda čistoty pro HPLC. Rozpouštědlo se před použitím odplyní. Je nutné používat izokratickou eluci. Poměr metanol/voda je nutné používat s minimálním obsahem vody 25 %. V obvyklém případě je pro eluci sloučenin o log P 6 během jedné hodiny při průtokové rychlosti 1 ml.min^-1 vhodná směs metanol/voda 3:1 (obj.). U sloučenin s vysokým log P může být nutné zkrátit eluční čas ( stejně tak u referenčních látek) snížením polarity mobilní fáze nebo délky kolony.
Látky s velmi nízkou rozpustností v n-oktanolu mají tendenci poskytovat metodou HPLC abnormálně nízké hodnoty log P_ow; píky těchto sloučenin někdy doprovázejí čelo rozpouštědla. Je to pravděpodobně způsobeno skutečností, že proces rozdělení je příliš pomalý, než aby se dosáhlo rovnováhy za dobu, kterou obvykle trvá dělení metodou HPLC. Pro dosažení spolehlivé hodnoty pak může být účinné snížení průtokové rychlosti nebo snížení poměru metanol/voda (případně obojí).
Zkoušená i referenční látka musí být rozpustné v mobilní fázi v dostatečných koncentracích, umožňujících jejich detekci. Pouze ve výjimečných případech se smějí u směsi metanol/voda použít aditiva, protože aditiva mění vlastnosti kolony. V případě chromatografů s aditivy je povinné použití samostatné kolony téhož typu. Není-li vhodná směs metanol-voda, lze použít směsi jiných organických rozpouštědel s vodou, např. etanol-voda nebo acetonitril-voda.
Pro disociovatelné látky je kritické pH eluentu. Musí ležet v pracovní oblasti pH kolony, která je obvykle mezi 2 a 8. Doporučuje se použití tlumivých roztoků. Je nutné dbát toho, aby se zabránilo srážení solí a znehodnocení kolony, ke kterému dochází u některých směsí organické fáze s tlumivým roztokem. Měření pomocí HPLC se stacionárními fázemi na bázi oxidu křemičitého při pH vyšším než 8 se nedoporučuje, protože použití alkalické mobilní fáze může vyvolat rychlé narušení funkce kolony.
Roztoky
Referenční látky musí být nejvyšší dostupné čistoty. Sloučeniny, které se používají pro zkoušení nebo kalibraci, se pokud možno rozpustí v mobilní fázi.
Zkušební podmínky
Teplota během měření nesmí kolísat o více než 2 K.

1. 6. 3. 2 Měření
Výpočet mrtvého času t_o
Mrtvý čas t₀ je možné stanovit buď pomocí homologické řady (např. n-alkylmetylketonů) nebo nezadržovaných organických sloučenin (např. thiomočoviny nebo formamidu). Pro výpočet mrtvého času t0 s použitím homologické řady se nastříkne sada alespoň sedmi členů homologické řady a stanoví se příslušné retenční časy. Neupravené retenční časy t_{r(nc + 1)} se vynesou jako funkce t_{r(nc )} a stanoví se absolutní člen a a směrnice b regresní rovnice:
$t_{r(nc+1)}=a+b.t_{r\left(nc\right)}$
(n_c = počet atomů uhlíku).
Mrtvý čas t_o je pak dán vztahem:
$t_0=\frac{a}{1-b}$
Kalibrační křivka
Následujícím krokem je sestrojení korelační závislosti log k na log P pro příslušné referenční sloučeniny. V praxi se současně nastříkne soubor 5 až 10 standardních referenčních sloučenin, jejichž log P leží v očekávané oblasti, a stanoví se retenční časy, nejlépe zapisovacím integrátorem napojeným na detekční systém. Vypočtou se příslušné logaritmy kapacitních faktorů, log k, a vynesou se jako funkce log P, stanovených metodou třepací láhve. Kalibrace se provádí v pravidelných intervalech, nejméně jednou denně, aby bylo možné brát do úvahy případné změny ve funkci kolony.
Stanovení kapacitního faktoru zkoušené látky
Zkoušená látka se nastříkne v co nejmenším množství mobilní fáze. Stanoví se retenční čas (dvakrát), umožňující výpočet kapacitního faktoru k. Z korelační křivky referenčních látek je možné interpolovat rozdělovací koeficient zkoušené látky. U velmi nízkých a velmi vysokých rozdělovacích koeficientů je nutná extrapolace. V těchto případech je nutno věnovat zvláštní pozornost intervalům spolehlivosti regresní přímky.