1. 6 POPIS METODY

1. 6. 1 Předběžný odhad rozdělovacího koeficientu
Hodnotu rozdělovacího koeficientu lze nejlépe odhadnout na základě výpočtu (viz příloha 1), nebo tam, kde je to vhodné, z poměru rozpustností zkoušené látky v čistých rozpouštědlech (10).

1. 6. 2 Metoda třepací láhve

1. 6. 2. 1 Příprava
n-Oktanol: Stanovení rozdělovacího koeficientu je nutné provést s velmi čistým n- oktanolem analytické čistoty.
Voda: Je nutné použít vodu destilovanou nebo dvakrát destilovanou ve skleněné nebo křemenné aparatuře. U disociovatelných látek je, kde je to opodstatněné, nutné použít místo vody tlumivé roztoky.
Poznámka:
Nelze používat vodu odebíranou přímo z iontoměniče.

1.6.2.1.1 Počáteční nasycení rozpouštědel
Před stanovením rozdělovacího koeficientu se fáze rozpouštědlového systému vzájemně nasytí třepáním při teplotě zkoušky. K tomu je praktické třepat na mechanické třepačce ve dvou velkých zásobních lahvích n-oktanol nebo vodu, každé rozpouštědlo s dostatečným množstvím druhého rozpouštědla, 24 hodin a pak nechat stát tak dlouho, až se obě fáze oddělí a je dosaženo stavu nasycení.

1.6.2.1.2 Příprava zkoušky
Celkový objem dvoufázového systému musí téměř vyplňovat zkušební nádobu. Tím se zamezí ztrátám látek vypařováním. Poměry objemů a množství látky, kterých je nutné použít, jsou ovlivněny těmito faktory:
- předběžné určeným rozdělovacím koeficientem (viz výše),
- minimálním množstvím zkoušené látky, potřebným pro analytický postup a
- omezením maximální koncentrace v každé fázi na 0,01 mol.l^-1.
Provedou se tři stanovení. Při prvním se použije vypočtený poměr objemů n- oktanolu a vody, při druhém se tento poměr dělí dvěma a při třetím se tento poměr násobí dvěma (např. 1:1, 1:2, 2:1).

1.6.2.1.3 Zkoušená látka
Připraví se zásobní roztok v n-oktanolu, předběžně nasycený vodou. Koncentraci tohoto zásobního roztoku je před jeho použitím ke stanovení rozdělovacího koeficientu nutné přesně stanovit. Tento roztok je nutné přechovávat za podmínek, které zaručují jeho stálost.

1. 6. 2. 2 Experimentální podmínky
Teplotu při stanovení je nutné udržovat konstantní (± 1 °C). Musí ležet v intervalu mezi 20 a 25 °C.

1. 6. 2. 3 Postup měření

1.6.2.3.1 Ustavení rovnováhy rozdělení
Pro každou z podmínek stanovení je nutné připravit dvě zkušební nádoby, obsahující potřebná přesně odměřená množství obou rozpouštědel spolu s potřebným množstvím zásobního roztoku.
Fáze n-oktanolu je nutné měřit objemově. Zkušební nádoby je nutné buď umístit do vhodné třepačky, nebo třepat ručně. Používá-li se zkumavka odstředivky, spočívá doporučený postup v tom, že se zkumavka rychle otočí o 180° okolo své příčné osy, takže případný uzavřený vzduch stoupá vzhůru oběma fázemi. Zkušenost ukazuje, že k ustavení rovnovážného rozdělení obvykle stačí 50 těchto otočení. Pro dosažení jistoty se doporučuje 100 otočení během pěti minut.

1.6.2.3.2 Oddělení fází
Pro oddělení fází je v případě potřeby nutné směs odstředit. To je možné provést na laboratorní odstředivce uchovávané při pokojové teplotě, nebo používá-li se odstředivka bez regulace teploty, je zkumavky nutné udržovat pro ustavení rovnováhy nejméně jednu hodinu před analýzou na teplotě stanovení.

1. 6. 2. 4 Analýza
Pro stanovení rozdělovacího koeficientu je nutné zjistit koncentrace zkoušené látky v obou fázích. To je možné provést tak, že se z každé z obou fází, z každé zkumavky a pro každou podmínku odebere alikvotní podíl, který se analyzuje zvoleným postupem. Celkové množství látky obsažené v obou fázích se vypočte a porovná s množstvím látky dodaným na začátku.
Odběr vzorku z vodné fáze je nutné provést postupem, minimalizujícím riziko kontaminace stopami n-oktanolu: k odběru vzorků z vodné fáze je možné použít skleněnou injekční stříkačku s výměnnou jehlou. Stříkačka se nejprve částečně naplní vzduchem. Tento vzduch se při průchodu jehly vrstvou n-oktanolu opatrně vytlačí. Do stříkačky se nasaje přiměřený objem vodné fáze. Stříkačka se rychle vyjme z roztoku a jehla se sejme. Obsah stříkačky je pak možné použít jako vzorek vodné fáze. Koncentrace v obou od sebe oddělených fázích se nejlépe stanoví metodou specifickou pro danou látku. Příklady možných vhodných analytických metod jsou:
- fotometrické metody,
- plynová chromatografie,
- vysokoúčinná kapalinová chromatografie.

1. 6. 3 Metoda HPLC

1. 6. 3. 1 Příprava
Aparatura
Je zapotřebí kapalinový chromatograf, vybavený bezpulzním čerpadlem a vhodným detekčním zařízením. Doporučuje se používat vstřikovací ventil se vstřikovacími smyčkami. Přítomnost polárních skupin ve stacionární fázi může závažně znehodnotit funkci kolony HPLC. Proto musí mít stacionární fáze minimální podíl polárních skupin (11). Je možné používat komerční mikročásticové náplně s reverzními fázemi nebo hotové kolony s náplní. Mezi vstřikovacím systémem a analytickou kolonou musí být umístěna ochranná předkolona.
Mobilní fáze
K přípravě elučního rozpouštědla se používají metanol čistoty pro HPLC a voda čistoty pro HPLC. Rozpouštědlo se před použitím odplyní. Je nutné používat izokratickou eluci. Poměr metanol/voda je nutné používat s minimálním obsahem vody 25 %. V obvyklém případě je pro eluci sloučenin o log P 6 během jedné hodiny při průtokové rychlosti 1 ml.min^-1 vhodná směs metanol/voda 3:1 (obj.). U sloučenin s vysokým log P může být nutné zkrátit eluční čas ( stejně tak u referenčních látek) snížením polarity mobilní fáze nebo délky kolony.
Látky s velmi nízkou rozpustností v n-oktanolu mají tendenci poskytovat metodou HPLC abnormálně nízké hodnoty log P_ow; píky těchto sloučenin někdy doprovázejí čelo rozpouštědla. Je to pravděpodobně způsobeno skutečností, že proces rozdělení je příliš pomalý, než aby se dosáhlo rovnováhy za dobu, kterou obvykle trvá dělení metodou HPLC. Pro dosažení spolehlivé hodnoty pak může být účinné snížení průtokové rychlosti nebo snížení poměru metanol/voda (případně obojí).
Zkoušená i referenční látka musí být rozpustné v mobilní fázi v dostatečných koncentracích, umožňujících jejich detekci. Pouze ve výjimečných případech se smějí u směsi metanol/voda použít aditiva, protože aditiva mění vlastnosti kolony. V případě chromatografů s aditivy je povinné použití samostatné kolony téhož typu. Není-li vhodná směs metanol-voda, lze použít směsi jiných organických rozpouštědel s vodou, např. etanol-voda nebo acetonitril-voda.
Pro disociovatelné látky je kritické pH eluentu. Musí ležet v pracovní oblasti pH kolony, která je obvykle mezi 2 a 8. Doporučuje se použití tlumivých roztoků. Je nutné dbát toho, aby se zabránilo srážení solí a znehodnocení kolony, ke kterému dochází u některých směsí organické fáze s tlumivým roztokem. Měření pomocí HPLC se stacionárními fázemi na bázi oxidu křemičitého při pH vyšším než 8 se nedoporučuje, protože použití alkalické mobilní fáze může vyvolat rychlé narušení funkce kolony.
Roztoky
Referenční látky musí být nejvyšší dostupné čistoty. Sloučeniny, které se používají pro zkoušení nebo kalibraci, se pokud možno rozpustí v mobilní fázi.
Zkušební podmínky
Teplota během měření nesmí kolísat o více než 2 K.

1. 6. 3. 2 Měření
Výpočet mrtvého času t_o
Mrtvý čas t₀ je možné stanovit buď pomocí homologické řady (např. n-alkylmetylketonů) nebo nezadržovaných organických sloučenin (např. thiomočoviny nebo formamidu). Pro výpočet mrtvého času t0 s použitím homologické řady se nastříkne sada alespoň sedmi členů homologické řady a stanoví se příslušné retenční časy. Neupravené retenční časy t_{r(nc + 1)} se vynesou jako funkce t_{r(nc )} a stanoví se absolutní člen a a směrnice b regresní rovnice:
$t_{r(nc+1)}=a+b.t_{r\left(nc\right)}$
(n_c = počet atomů uhlíku).
Mrtvý čas t_o je pak dán vztahem:
$t_0=\frac{a}{1-b}$
Kalibrační křivka
Následujícím krokem je sestrojení korelační závislosti log k na log P pro příslušné referenční sloučeniny. V praxi se současně nastříkne soubor 5 až 10 standardních referenčních sloučenin, jejichž log P leží v očekávané oblasti, a stanoví se retenční časy, nejlépe zapisovacím integrátorem napojeným na detekční systém. Vypočtou se příslušné logaritmy kapacitních faktorů, log k, a vynesou se jako funkce log P, stanovených metodou třepací láhve. Kalibrace se provádí v pravidelných intervalech, nejméně jednou denně, aby bylo možné brát do úvahy případné změny ve funkci kolony.
Stanovení kapacitního faktoru zkoušené látky
Zkoušená látka se nastříkne v co nejmenším množství mobilní fáze. Stanoví se retenční čas (dvakrát), umožňující výpočet kapacitního faktoru k. Z korelační křivky referenčních látek je možné interpolovat rozdělovací koeficient zkoušené látky. U velmi nízkých a velmi vysokých rozdělovacích koeficientů je nutná extrapolace. V těchto případech je nutno věnovat zvláštní pozornost intervalům spolehlivosti regresní přímky.