I AKUTNÍ TOXICITA PRO RYBY

1 METODA

1. 1 ÚVOD
Účelem této zkoušky je určit akutní letální toxicitu látek pro sladkovodní ryby. Aby se co nejvíce usnadnil výběr nejvhodnější zkušební metody (statické, semistatické nebo průtokové) a zajistily se dostatečně konstantní koncentrace zkoušené látky po celou dobu experimentu, je nutné mít v co nejúplnější míře k dispozici údaje o rozpustnosti látky ve vodě, o tenzi páry, o chemické stabilitě, o disociační konstantě a o biologické rozložitelnosti zkoumané látky.
Jak při plánování tak i při interpretaci výsledků je třeba brát v úvahu další potřebné údaje (např. strukturní vzorec, stupeň čistoty, druh a procentuální podíl významných nečistot, přítomnost a množství aditiv, jakož i rozdělovací koeficient n - oktanol/voda).

1. 2 DEFINICE A JEDNOTKY
Akutní toxicitou se rozumí zjevný nežádoucí účinek, který v organismu vyvolá během krátké doby působení (řádově dny) daná látka. Při této zkoušce se vyjadřuje akutní toxicita jako střední letální koncentrace (LC₅₀); to je taková koncentrace látky ve vodě, která během trvalé expozice po určitou dobu usmrtí 50 % jedinců zkušební skupiny ryb.
Koncetrace zkoušené látky se udávají jako hmotnost na objem (mg.l^-1). Mohou se také vyjádřit ve hmotnostních podílech (mg.kg^-1).

1. 3 REFERENČNÍ LÁTKY
Aby se prokázalo, že se reakce zkušebních druhů ryb za experimentálních podmínek v laboratoři podstatně nezměnila je možné provést kontrolní zkoušku s referenční látkou.
Referenční látky nejsou pro tuto zkoušku stanoveny.

1. 4 PRINCIP METODY
Aby se prokázalo, že LC₅₀ je vyšší než 100 mg.l^-1 může se provést limitní zkouška.
Ryby se vystaví účinku různých koncentrací studované látky přidané do vody po dobu 96 hodin. Úhyny se zjišťují nejméně každých 24 hodin a pokud je to možné, vypočtou se při každém pozorování také koncentrace, které usmrtí 50 % ryb (LC₅₀).

1. 5 KRITÉRIA KVALITY
Kritéria kvality se vztahují na limitní zkoušku i na úplnou zkoušku.
Úhyn v kontrolních skupinách nesmí přesáhnout 10 % (nebo jednu rybu, pokud se použije skupina menší než deset jedinců) až do konce zkoušky.
Koncentrace rozpuštěného kyslíku se musí udržet na 60 % hodnot nasycení vzduchem.
Koncentrace zkoušených látek by neměla poklesnout pod 80 % původních koncentrací po celou dobu trvání zkoušky.
U látek, které se lehce rozpouštějí ve zkušebním médiu a dávají stabilní roztoky (netěkají, nerozkládají se, nehydrolyzují se či se neadsorbují), se počáteční koncentrace může pokládat za ekvivalentní s nominální koncentrací. To, že se koncentrace udržela na určité úrovni po celou dobu zkoušky a že kritéria kvality byla dodržena musí být dokladováno.
Pro látky, které jsou:
musí být počáteční koncentrace brána jako koncentrace naměřená na začátku zkoušky. Koncentrace musí být stanovována po určitém období jejího ustálení, ale před vložením ryb.
Za účelem stanovení aktuální expoziční koncentrace a kontroly dodržení kritérií kvality se musí ve všech případech provádět další měření koncentrace během zkoušky.
pH by se nemělo změnit o více než o 1 jednotku.

(i) slabě rozpustné ve zkušebním médiu, nebo

(ii) schopné vytvářet stabilní emulze nebo disperze, nebo

(iii) nestabilní ve vodných roztocích,

1. 6 POPIS METODY
Zkouška může být provedena jednou ze tří metod:
Statická metoda: Zkouška, při které zkoušený roztok neprotéká. (Roztoky se nemění během celé doby trvání zkoušky.)
Semistatická metoda: Zkouška bez průtoku zkoušeného roztoku, ale s jeho pravidelnou obměnou po delších časových úsecích (např. po 24 hodinách).
Průtoková metoda: Zkouška toxicity, při níž se voda ve zkušebních nádobách neustále obměňuje, přičemž studovaná látka se přivádí s vodou pro obnovu zkušebního média.

1. 6. 1 Činidla
Je možné používat pitnou vodu (nekontaminovanou škodlivými koncentracemi chloru, těžkých kovů nebo jiných látek), kvalitní přírodní vodu nebo upravenou vodu (viz příloha 1). Nejlépe se hodí voda o celkové tvrdosti od 10 do 250 mg.l^-1 (vztaženo na CaCO₃) a pH od 6,0 do 8,5.

1. 6. 1. 1 Roztoky zkoušených látek
Základní roztoky požadované síly jsou připravovány rozpuštěním látky v deionizované vodě nebo ve vodě podle odstavce 1. 6. 1. 2.
Zvolené koncentrace jsou připravovány zředěním základního roztoku. Když jsou zkoušeny vysoké koncentrace látky, lze tuto látku přímo naředit na potřebnou koncentraci.
Látky by měly být zkoušeny až do hranice jejich rozpustnosti. U některých látek (např. s nízkou rozpustností ve vodě nebo vysokým P_ow, nebo spíše tvořících stabilní disperze než pravé roztoky ve vodě) je možné provést zkoušku při koncentraci vyšší než je hranice rozpustnosti, abychom si zajistili, že bude dosažena maximální rozpustná/stabilní koncentrace. Je ovšem nutné, aby tato koncentrace jinak nenarušovala zkušební systém (např. vytvořením filmu na hladině bránícímu okysličení vody, atd).
Pro přípravu základních roztoků látek s nízkou rozpustností ve vodě se mohou použít ultrazvuková dispergace, organická rozpouštědla či emulgační látky. Když jsou použity pomocné látky měly by všechny zkoušené vzorky a koncentrace, včetně kontrol, obsahovat těchto látek stejné množství. Koncentrace pomocných látek by měla být minimální a v žádném případě by neměla přesáhnout 100 mg.l^-1 zkoušeného média.
Zkouška by se měla provádět bez korekcí pH. Dochází-li k výrazné změně pH, doporučuje se provést znovu zkoušku s korekcí pH a výsledky zaznamenat. V těchto případech by měla být hodnota pH základního roztoku přizpůsobena pH rozpouštědla (vody); pokud neexistují specifické důvody tak neučinit. Přednost se dává použití HCl a NaOH. Přizpůsobení pH nesmí ovlivnit významně koncentraci zkoušené látky v základním roztoku. Vznik chemické reakce nebo fyzikální precipitace ve zkušebním médiu jako následek přizpůsobení pH se musí zaznamenat.

1. 6. 1. 2 Voda pro chov ryb a zřeďování

1. 6. 2 Přístroje
Všechny přístroje musí být z chemicky inertního materiálu:
- zařízení pro automatické zřeďování (pro průtokovou metodu),
- přístroj pro měření koncentrace kyslíku,
- přístroj pro stanovení tvrdosti vody,
- přístroj pro měření teploty,
- přístroj pro měření pH.

1. 6. 3 Pokusné ryby
Ryby by měly být zdravé a bez zjevných malformací.
Použitý druh by měl být zvolen dle praktických kritérií jako je jejich dostupnost po celý rok, snadný chov, vhodnost pro zkoušení, relativní citlivost k chemickým látkám a jakékoliv další významné ekonomické a biologické faktory. Také by měl být brán ohled na potřebu srovnatelnosti získaných dat a na mezinárodní spolupráci (1) při volbě používaného druhu ryb.
Seznam doporučených druhů ryb pro provádění zkoušek je uveden v příloze 2; preferovanými druhy jsou danio pruhované a pstruh duhový.

1. 6. 3. 1 Chov
Je třeba, aby ryby pocházely pokud možno z jednoho chovu a byly přibližně stejné délky a stejného stáří. Nejméně 12 dní je třeba je chovat v těchto podmínkách:
Nádoby:
Pro ryby žijící ve studené vodě se doporučují nádoby o minimálním obsahu 300 l, pro ryby žijící v teplé vodě nádoby o minimálním obsahu 100 l.
Počet ryb (obsádka):
Podle metody (recirkulační nebo průtokové zařízení) a druhu ryb.
Voda:
Viz 1. 6. 1. 2.
Osvětlení:
12 až 16 hodin světla denně.
Koncentrace rozpuštěného kyslíku:
Nejméně 80 % hodnoty nasycení vzdušným kyslíkem.
Krmení:
Třikrát týdně nebo jednou denně; vysazení krmení 24 hodin před začátkem experimentu.

1. 6. 3. 2 Mortalita
Po aklimatizační době 48 hodin se sleduje mortalita a používají se tato kritéria:
- úhyny činí více než 10 % populace za 7 dní:
celá obsádka ryb se musí vyřadit;
- úhyny činí 5 až 10 % populace:
dobu chovu je třeba prodloužit o dalších 7 dní. Pokud nedojde k dalším případům úhynu, je rybí obsádka pro zkoušku použitelná, jinak nikoli;
- úhyny činí méně než 5 % populace:
rybí obsádka je pro zkoušku použitelná.

1. 6. 4 Aklimatizace
Všechny ryby je třeba nasadit nejméně na 7 dnů před použitím pro zkoušku do vody stejné kvality a stejné teploty, jaká se má používat při zkoušce.

1. 6. 5 Provedení zkoušky
Před vlastní zkouškou je možno provést zkoušku předběžnou. Tato předběžná zkouška poskytuje informace o rozsahu koncentrací pro vlastní zkoušku.
Mimo zkoušky s různými koncentracemi zkoušené látky je třeba provést kontrolní zkoušky bez zkoušené látky a kontrolní zkoušky s nosičem, pokud se nějaký použije, avšak bez zkoušené látky.
V závislosti na fyzikálních a chemických vlastnostech zkoušené látky se zvolí statický, semistatický či průtokový systém a dbá se na dodržení kritérií kvality.
Ryby se exponují zkoušené látce, jak je popsáno dále:
Trvání: 96 hodin
Počet jedinců: Nejméně 7 na každou koncentraci.
Nádrže: Vhodný objem vzhledem k doporučenému počtu ryb (obsádce)
Počet ryb: Jako největší množství ryb se ve statickém a semistatickém uspořádání doporučuje 1,0 g.l^-1, v průtokovém uspořádání je možné množství větší.
Koncentrace při zkoušce: Nejméně 5 různých koncentrací, které jsou odstupňovány činitelem nepřevyšujícím 2,2 a které pokrývají rozsah 0 % až 100 % mortality.
Voda: Viz 1. 6. 1. 2.
Osvětlení: 12 až 16 hodin světla denně.
Teplota: Podle druhu ryb (příloha 2), kolísající v mezích ± 1 °C při každé jednotlivé zkoušce.
Koncentrace rozpuštěného kyslíku: Ne nižší než 60 % hodnoty nasycení vzdušným kyslíkem při dané teplotě.
Krmení: Žádné.
Ryby se kontrolují po prvních 2 - 4 hodinách a dále nejméně každých 24 hodin. Ryby se považují za mrtvé, jestliže při dotyku ocasní ploutve nedochází k žádné reakci a nejsou-li patrné žádné dýchací pohyby. Mrtvé ryby je třeba odstranit ihned jakmile se zpozorují, a je třeba o tom učinit záznam.
Zaznamenávají se všechny zjevné abnormality (např. ztráta rovnováhy, změny v plavání, v dýchací funkci, v pigmentaci atd.).
Měření pH, obsahu rozpuštěného kyslíku a teploty je nutné provádět denně.
Limitní zkouška
S využitím postupů popsaných v této metodice se může provést limitní zkouška při koncentraci 100 mg.l^-1 za účelem prokázání skutečnosti, že LC₅₀ je vyšší než tato koncentrace.
Jestliže je povaha zkoušené látky taková, že nelze ve vodě dosáhnout koncentrace 100 mg.l^-1, měla by být provedena limitní zkouška při koncentraci odpovídající rozpustnosti této látky v použitém médiu (nebo při maximální koncentraci, kdy látka vytváří stabilní disperzi) (viz také bod 1. 6. 1. 1).
Limitní zkouška by měla být prováděna na 7 až 10 rybách a při stejném počtu ryb v kontrolách. (Podle binomické teorie použití 10 ryb s nulovým úhynem znamená 99,9 % pravděpodobnost, že LC₅₀ je větší než 100 mg.l^-1. Žádný úhyn ve zkouškách na 7, 8 nebo 9 rybách znamená nejméně 99 % pravděpodobnost, že LC₅₀ je větší než koncentrace použitá v limitní zkoušce.
Jestliže dojde k úhynům, musí se provést úplné zkoušení. Jsou-li pozorovány subletální účinky, musí být zaznamenány.

2 ÚDAJE A VYHODNOCENÍ
Na pravděpodobnostní lognormální papír se pro každou doporučenou a skutečně prověřovanou délku expozice (24, 48, 72 a 96 hodin) vynese úhyn proti koncentraci.
Pokud je to možné, mělo by se pro každou délku expozice stanovit LC₅₀ a hranice spolehlivosti (p = 0,05). Tyto hodnoty se zaokrouhlí na jedno, případně dvě desetinná místa.
V případech, kdy je úhel stoupání křivky závislosti procenta úhynů na koncentraci látky příliš strmý a hodnoty LC₅₀ nelze vypočítat, stačí grafický odhad těchto hodnot.
Když dvě po sobě jdoucí koncentrace odlišené činitelem 2,2 vyvolávají úhyn 0 a 100 % je zřejmé, že LC₅₀ se nachází mezi těmito hodnotami.
Pokud není možné udržet stabilitu nebo homogenitu studované látky, je třeba to zmínit ve zprávě z experimentu a interpretace výsledků by měla být opatrná.

3 ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
Pokud je to možné, obsahuje závěrečná zpráva následující informace:
- údaje o použitých rybách (vědecký název, kmen, dodavatel nebo zdroj odběru, předchozí ošetření, velikost a počet při jednotlivých koncentracích při experimentu),
- původ zřeďovací vody a její nejdůležitější chemické vlastnosti (pH, tvrdost, teplota),
- u látek s malou rozpustností ve vodě údaj o metodě přípravy základních a zkušebních roztoků,
- koncentrace všech pomocných látek,
- přehled použitých koncentrací a veškeré informace, které jsou k dispozici o stabilitě zkoušené látky při použitých koncentracích,
- při provádění chemických analýz údaje o použitých metodách a výsledky,
- výsledek limitní zkoušky, pokud byla provedena,
- důvody pro volbu a podrobnosti provedení zkoušky (např. trvání zkoušky, statické nebo semistatické uspořádání, rychlost dávkování, průtoková rychlost, zda byla voda provzdušňována, počet ryb, atd.),
- popis zkušebního zařízení,
- světelný režim,
- koncentrace rozpuštěného kyslíku, hodnoty pH, teplota roztoků při zkoušce každých 24 hodin,
- důkaz, že byla splněna kritéria kvality,
- tabulka kumulativních úhynů při každé koncentraci a při kontrolní zkoušce (případně i při kontrolním zkoušce s nosičem) při každé z doporučených dob pozorování,
- grafické znázornění křivky závislosti účinku na koncentraci na konci zkoušky,
- hodnoty LC₅₀ při každé z doporučených dob pozorování (pokud možno s 95% mezí spolehlivosti),
- použité statistické metody stanovení hodnot LC₅₀,
- při použití referenční látky údaj o výsledcích zkoušky s touto látkou,
- nejvyšší koncentrace bez úhynu ryb po dobu zkoušky,
- nejnižší koncentrace se 100 % úhynem ryb v době zkoušky.

4 LITERATURA

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 203, Decision of the Council, C(81) 30 final and updates.

(2) AFNOR - Determination of the acute toxicity of a substance to Brachydanio rerio- Static and Flow Through methods - NFT 90-303 June 1985.

(3) AFNOR Determination of the acute toxicity of a substance to Salmo gairdneri - Static and Flow Through methods - NFT 90-305 June 1985.

(4) ISO 7346/1, /2 a /3 - Water Quality - Determination of the acute lethal toxicity of substances to a fresh water fish (Brachydanio rerio Hamilton - Buchanan - Teleostei, Cypridinae). Part 1: Static method. Part 2: Semi-static method. Part 3: Flow-through method.

(5) Eidgenössisches Department des Innern, Schweiz: Richtlinien für Probenahme und Normung von Wasseruntersuchungsmethoden - Part II 1974.

(6) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen, 38 412 (L1) und L(15).

(7) JIS K 0102, Acute toxicity test for fish.

(8) NEN 6506 - Water - Bepaling van de akute toxiciteit met behulp van Poecilia reticulata.

(9) Environmental Protection Agency. Methods for the Acute Toxicity Tests with Fish, Macroinvertebrates and Amphibians. The Committee on Methods for Toxicity Tests with Aquatic Organisms. Ecological Research Series EPA - 660 - 75 - 009, 1975.

(10) Enviromental Protection Agency,. January, Environmental Monitoring and Support Laboratory, Office of Research and Development. EPA - 600/4 - 78 - 012, 1978.

(11) Environmental Protection Agency, Toxic Substance Control, Part IV, 16 March 1979.

(12) Standard methods for the Examination of Water and Wastewater. 14th edition, APHA-AWWA-WPCF, 1975.

(13) Commission of the European Communities, Inter-laboratory test programme concerning the study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to the fish. CEE Study D. 8368, 22 March 1979.

(14) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamt zum akuten Fisch - Test. Rudolph, P. und Boje, R. Ökotoxikologie, Grundlagen für ökotoxikologische Bewertung von Umweltchemikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986.

(15) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. A simplified method for evaluating dose effects experiments. J. Pharm. Exp. Therap., Vol. 96, 1949, s. 99.

(16) Finney, D. J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, Weycombe, U. K., 1978.

(17) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. Bioassay methods for acute toxicity, Water Res., 1969, vol. 3, 793 - 821.

(18) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II Utilising and applying bioassay results. Water Res., 1970, vol. 4, 3 - 32.

(19) Stephan, C. E. Methods for calculating an LC50. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F. I. Mayer and J. L. Hamelink). American Society for Testing and Materials, ASTM STP 634, 1977, 65-84.

(20) Stephan, C. E., Busch, K. A., Smith, R., Burke, J. and Andrews, R. W. A computer program for calculating an LC50. US EPA.