1. 6 POPIS METODY
Zkouška může být provedena jednou ze tří metod:
Statická metoda: Zkouška, při které zkoušený roztok neprotéká. (Roztoky se nemění během celé doby trvání zkoušky.)
Semistatická metoda: Zkouška bez průtoku zkoušeného roztoku, ale s jeho pravidelnou obměnou po delších časových úsecích (např. po 24 hodinách).
Průtoková metoda: Zkouška toxicity, při níž se voda ve zkušebních nádobách neustále obměňuje, přičemž studovaná látka se přivádí s vodou pro obnovu zkušebního média.

1. 6. 1 Činidla
Je možné používat pitnou vodu (nekontaminovanou škodlivými koncentracemi chloru, těžkých kovů nebo jiných látek), kvalitní přírodní vodu nebo upravenou vodu (viz příloha 1). Nejlépe se hodí voda o celkové tvrdosti od 10 do 250 mg.l^-1 (vztaženo na CaCO₃) a pH od 6,0 do 8,5.

1. 6. 1. 1 Roztoky zkoušených látek
Základní roztoky požadované síly jsou připravovány rozpuštěním látky v deionizované vodě nebo ve vodě podle odstavce 1. 6. 1. 2.
Zvolené koncentrace jsou připravovány zředěním základního roztoku. Když jsou zkoušeny vysoké koncentrace látky, lze tuto látku přímo naředit na potřebnou koncentraci.
Látky by měly být zkoušeny až do hranice jejich rozpustnosti. U některých látek (např. s nízkou rozpustností ve vodě nebo vysokým P_ow, nebo spíše tvořících stabilní disperze než pravé roztoky ve vodě) je možné provést zkoušku při koncentraci vyšší než je hranice rozpustnosti, abychom si zajistili, že bude dosažena maximální rozpustná/stabilní koncentrace. Je ovšem nutné, aby tato koncentrace jinak nenarušovala zkušební systém (např. vytvořením filmu na hladině bránícímu okysličení vody, atd).
Pro přípravu základních roztoků látek s nízkou rozpustností ve vodě se mohou použít ultrazvuková dispergace, organická rozpouštědla či emulgační látky. Když jsou použity pomocné látky měly by všechny zkoušené vzorky a koncentrace, včetně kontrol, obsahovat těchto látek stejné množství. Koncentrace pomocných látek by měla být minimální a v žádném případě by neměla přesáhnout 100 mg.l^-1 zkoušeného média.
Zkouška by se měla provádět bez korekcí pH. Dochází-li k výrazné změně pH, doporučuje se provést znovu zkoušku s korekcí pH a výsledky zaznamenat. V těchto případech by měla být hodnota pH základního roztoku přizpůsobena pH rozpouštědla (vody); pokud neexistují specifické důvody tak neučinit. Přednost se dává použití HCl a NaOH. Přizpůsobení pH nesmí ovlivnit významně koncentraci zkoušené látky v základním roztoku. Vznik chemické reakce nebo fyzikální precipitace ve zkušebním médiu jako následek přizpůsobení pH se musí zaznamenat.

1. 6. 1. 2 Voda pro chov ryb a zřeďování

1. 6. 2 Přístroje
Všechny přístroje musí být z chemicky inertního materiálu:
- zařízení pro automatické zřeďování (pro průtokovou metodu),
- přístroj pro měření koncentrace kyslíku,
- přístroj pro stanovení tvrdosti vody,
- přístroj pro měření teploty,
- přístroj pro měření pH.

1. 6. 3 Pokusné ryby
Ryby by měly být zdravé a bez zjevných malformací.
Použitý druh by měl být zvolen dle praktických kritérií jako je jejich dostupnost po celý rok, snadný chov, vhodnost pro zkoušení, relativní citlivost k chemickým látkám a jakékoliv další významné ekonomické a biologické faktory. Také by měl být brán ohled na potřebu srovnatelnosti získaných dat a na mezinárodní spolupráci (1) při volbě používaného druhu ryb.
Seznam doporučených druhů ryb pro provádění zkoušek je uveden v příloze 2; preferovanými druhy jsou danio pruhované a pstruh duhový.

1. 6. 3. 1 Chov
Je třeba, aby ryby pocházely pokud možno z jednoho chovu a byly přibližně stejné délky a stejného stáří. Nejméně 12 dní je třeba je chovat v těchto podmínkách:
Nádoby:
Pro ryby žijící ve studené vodě se doporučují nádoby o minimálním obsahu 300 l, pro ryby žijící v teplé vodě nádoby o minimálním obsahu 100 l.
Počet ryb (obsádka):
Podle metody (recirkulační nebo průtokové zařízení) a druhu ryb.
Voda:
Viz 1. 6. 1. 2.
Osvětlení:
12 až 16 hodin světla denně.
Koncentrace rozpuštěného kyslíku:
Nejméně 80 % hodnoty nasycení vzdušným kyslíkem.
Krmení:
Třikrát týdně nebo jednou denně; vysazení krmení 24 hodin před začátkem experimentu.

1. 6. 3. 2 Mortalita
Po aklimatizační době 48 hodin se sleduje mortalita a používají se tato kritéria:
- úhyny činí více než 10 % populace za 7 dní:
celá obsádka ryb se musí vyřadit;
- úhyny činí 5 až 10 % populace:
dobu chovu je třeba prodloužit o dalších 7 dní. Pokud nedojde k dalším případům úhynu, je rybí obsádka pro zkoušku použitelná, jinak nikoli;
- úhyny činí méně než 5 % populace:
rybí obsádka je pro zkoušku použitelná.

1. 6. 4 Aklimatizace
Všechny ryby je třeba nasadit nejméně na 7 dnů před použitím pro zkoušku do vody stejné kvality a stejné teploty, jaká se má používat při zkoušce.

1. 6. 5 Provedení zkoušky
Před vlastní zkouškou je možno provést zkoušku předběžnou. Tato předběžná zkouška poskytuje informace o rozsahu koncentrací pro vlastní zkoušku.
Mimo zkoušky s různými koncentracemi zkoušené látky je třeba provést kontrolní zkoušky bez zkoušené látky a kontrolní zkoušky s nosičem, pokud se nějaký použije, avšak bez zkoušené látky.
V závislosti na fyzikálních a chemických vlastnostech zkoušené látky se zvolí statický, semistatický či průtokový systém a dbá se na dodržení kritérií kvality.
Ryby se exponují zkoušené látce, jak je popsáno dále:
Trvání: 96 hodin
Počet jedinců: Nejméně 7 na každou koncentraci.
Nádrže: Vhodný objem vzhledem k doporučenému počtu ryb (obsádce)
Počet ryb: Jako největší množství ryb se ve statickém a semistatickém uspořádání doporučuje 1,0 g.l^-1, v průtokovém uspořádání je možné množství větší.
Koncentrace při zkoušce: Nejméně 5 různých koncentrací, které jsou odstupňovány činitelem nepřevyšujícím 2,2 a které pokrývají rozsah 0 % až 100 % mortality.
Voda: Viz 1. 6. 1. 2.
Osvětlení: 12 až 16 hodin světla denně.
Teplota: Podle druhu ryb (příloha 2), kolísající v mezích ± 1 °C při každé jednotlivé zkoušce.
Koncentrace rozpuštěného kyslíku: Ne nižší než 60 % hodnoty nasycení vzdušným kyslíkem při dané teplotě.
Krmení: Žádné.
Ryby se kontrolují po prvních 2 - 4 hodinách a dále nejméně každých 24 hodin. Ryby se považují za mrtvé, jestliže při dotyku ocasní ploutve nedochází k žádné reakci a nejsou-li patrné žádné dýchací pohyby. Mrtvé ryby je třeba odstranit ihned jakmile se zpozorují, a je třeba o tom učinit záznam.
Zaznamenávají se všechny zjevné abnormality (např. ztráta rovnováhy, změny v plavání, v dýchací funkci, v pigmentaci atd.).
Měření pH, obsahu rozpuštěného kyslíku a teploty je nutné provádět denně.
Limitní zkouška
S využitím postupů popsaných v této metodice se může provést limitní zkouška při koncentraci 100 mg.l^-1 za účelem prokázání skutečnosti, že LC₅₀ je vyšší než tato koncentrace.
Jestliže je povaha zkoušené látky taková, že nelze ve vodě dosáhnout koncentrace 100 mg.l^-1, měla by být provedena limitní zkouška při koncentraci odpovídající rozpustnosti této látky v použitém médiu (nebo při maximální koncentraci, kdy látka vytváří stabilní disperzi) (viz také bod 1. 6. 1. 1).
Limitní zkouška by měla být prováděna na 7 až 10 rybách a při stejném počtu ryb v kontrolách. (Podle binomické teorie použití 10 ryb s nulovým úhynem znamená 99,9 % pravděpodobnost, že LC₅₀ je větší než 100 mg.l^-1. Žádný úhyn ve zkouškách na 7, 8 nebo 9 rybách znamená nejméně 99 % pravděpodobnost, že LC₅₀ je větší než koncentrace použitá v limitní zkoušce.
Jestliže dojde k úhynům, musí se provést úplné zkoušení. Jsou-li pozorovány subletální účinky, musí být zaznamenány.