1. 6. 5 Provedení zkoušky
Před vlastní zkouškou je možno provést zkoušku předběžnou. Tato předběžná zkouška poskytuje informace o rozsahu koncentrací pro vlastní zkoušku.
Mimo zkoušky s různými koncentracemi zkoušené látky je třeba provést kontrolní zkoušky bez zkoušené látky a kontrolní zkoušky s nosičem, pokud se nějaký použije, avšak bez zkoušené látky.
V závislosti na fyzikálních a chemických vlastnostech zkoušené látky se zvolí statický, semistatický či průtokový systém a dbá se na dodržení kritérií kvality.
Ryby se exponují zkoušené látce, jak je popsáno dále:
Trvání: 96 hodin
Počet jedinců: Nejméně 7 na každou koncentraci.
Nádrže: Vhodný objem vzhledem k doporučenému počtu ryb (obsádce)
Počet ryb: Jako největší množství ryb se ve statickém a semistatickém uspořádání doporučuje 1,0 g.l^-1, v průtokovém uspořádání je možné množství větší.
Koncentrace při zkoušce: Nejméně 5 různých koncentrací, které jsou odstupňovány činitelem nepřevyšujícím 2,2 a které pokrývají rozsah 0 % až 100 % mortality.
Voda: Viz 1. 6. 1. 2.
Osvětlení: 12 až 16 hodin světla denně.
Teplota: Podle druhu ryb (příloha 2), kolísající v mezích ± 1 °C při každé jednotlivé zkoušce.
Koncentrace rozpuštěného kyslíku: Ne nižší než 60 % hodnoty nasycení vzdušným kyslíkem při dané teplotě.
Krmení: Žádné.
Ryby se kontrolují po prvních 2 - 4 hodinách a dále nejméně každých 24 hodin. Ryby se považují za mrtvé, jestliže při dotyku ocasní ploutve nedochází k žádné reakci a nejsou-li patrné žádné dýchací pohyby. Mrtvé ryby je třeba odstranit ihned jakmile se zpozorují, a je třeba o tom učinit záznam.
Zaznamenávají se všechny zjevné abnormality (např. ztráta rovnováhy, změny v plavání, v dýchací funkci, v pigmentaci atd.).
Měření pH, obsahu rozpuštěného kyslíku a teploty je nutné provádět denně.
Limitní zkouška
S využitím postupů popsaných v této metodice se může provést limitní zkouška při koncentraci 100 mg.l^-1 za účelem prokázání skutečnosti, že LC₅₀ je vyšší než tato koncentrace.
Jestliže je povaha zkoušené látky taková, že nelze ve vodě dosáhnout koncentrace 100 mg.l^-1, měla by být provedena limitní zkouška při koncentraci odpovídající rozpustnosti této látky v použitém médiu (nebo při maximální koncentraci, kdy látka vytváří stabilní disperzi) (viz také bod 1. 6. 1. 1).
Limitní zkouška by měla být prováděna na 7 až 10 rybách a při stejném počtu ryb v kontrolách. (Podle binomické teorie použití 10 ryb s nulovým úhynem znamená 99,9 % pravděpodobnost, že LC₅₀ je větší než 100 mg.l^-1. Žádný úhyn ve zkouškách na 7, 8 nebo 9 rybách znamená nejméně 99 % pravděpodobnost, že LC₅₀ je větší než koncentrace použitá v limitní zkoušce.
Jestliže dojde k úhynům, musí se provést úplné zkoušení. Jsou-li pozorovány subletální účinky, musí být zaznamenány.