XIV STANOVENÍ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI ANIONTOVÝCH POVRCHOVĚ AKTIVNÍCH LÁTEK
PŘEDBĚŽNÁ ÚPRAVA ZKOUŠENÝCH VÝROBKŮ

1. 1 ZAŘÍZENÍ POTŘEBNÉ PRO MĚŘENÍ
Měřicí metoda používá malé zařízení zpracovávající aktivovaný kal, znázorněné na obrázku 1 a podrobněji na obrázku 2.
Zařízení sestává ze zásobníku syntetické odpadní vody A, dávkovacího čerpadla B, provzdušňovací nádoby C, usazovací nádoby D, mamutky E pro recyklaci aktivovaného kalu a nádoby F pro shromažďování upravené odtokové vody.
Nádoby A a F musí být ze skla nebo z vhodného plastu o obsahu nejméně 24 litrů. Čerpadlo B musí zaručovat konstantní průtok syntetické odpadní vody do provzdušňovací nádoby; tato n ádoba obsahuje za normálního provozu tři litry směsné kapaliny. Porézní provzdušňovací kostka G je ponořena v nádobě C u vrcholu kužele. Množství vzduchu prošlé provzdušňovačem se sleduje průtokoměrem H.

2. 1 ALKOHOLICKÝ EXTRAKT
Účelem extrakce je oddělit z komerčního výrobku nerozpustné a anorganické složky, které by mohly za určitých podmínek narušit zkoušky biologické rozložitelnosti.
Kvantitativní oddělení těchto složek není nutné, není nutná ani kvantitativní extrakce aktivních složek. Je však třeba, aby nejméně 90 % složek aktivních k methylenové modři, z výrobku, který má být zkoušen, bylo zkoncentrováno v extraktu.
Pro přípravu alkoholových extraktů jsou vhodné dvě metody, jedna používající ethanol a druhá používající izopropanol. Izopropanolová metoda je zvláště vhodná, jestliže se jedná o velká množství materiálu, jak vyžaduje potvrzující zkouška.

2. 1. 1 Ethanolový extrakt

2. 1. 1. 1 Příprava vzorků

(i) Prášky
Připraví se přibližně 250 g vzorku buď kvartováním nebo podle Doporučení ISO č. 607.
Vzorek se rozdrtí na domácím rotačním mlýnku tak, aby výsledné částice prachu nebyly větší než 250 mikronů.
Prášek se opatrně promísí a uloží do vhodného obalu.

(ii) Kapaliny
Odváží se asi 40 g homogenizované látky s přesností na 1 g a přenese se do baňky s kulatým dnem, popsané v 2. 1. 1. 2 (iii) níže.
Přidá se 50 ml ethanolu (2. 1. 1. 2 (ii) a odpařuje se na vodní lázni do sucha za současného odsávání těkavých zplodin tak dlouho, až dvě následná vážení se neliší více než o 0,1 g. K vážení může být použita jakákoliv váha s přesností 0,01 g.

2. 1. 1. 2 Příprava roztoku v ethanolu

(i) Princip
Ethanolová extrakce dostatečného množství látky pro stanovení obsahu mýdla nebo jiných aniontů nebo pro biologické zkoušky.

(ii) Činidlo
95 % - 96 % ethanol.

(iii) Vybavení
Běžné laboratorní vybavení, které obsahuje především:
baňku objemu 1 l s kulatým dnem, krátkým hrdlem a zábrusem 29/32;
vertikální chladič se zábrusem 29/ 32 o délce 400 mm;
fritový filtr 10 - 20 mikronů;
odměrnou baňku o objemu 1 l.

2. 1. 1. 3 Postup
Známá navážka E (tj. 40 g ± 1 g) látky (2. 1. 1. 1 (i)) se nasype do 1 litrové baňky nebo se použije suchý extrakt, připravený dle 2. 1. 1. 1 (ii).
Přidá se 500 ml ethanolu (2. 1. 1. 2 (ii)), připojí se chladič a vaří se po dobu 15 minut. Poté se dekantuje kapalná vrstva a horká se odsaje přes fritový filtr. Tento postup se aplikuje na zbytky v baňce 2 x, k čemuž se použije dvou dávek po 200 ml ethanolu. Extrakty se spojí kvantitativně s oplachy filtru v odměrné baňce, doplní do 1 litru ethanolem a opatrně se promísí.

2. 1. 2 Isopropanolový extrakt
Potřebné množství, které odpovídá asi 50 g MBAS v extraktu, se vypočítá z obsahu MBAS v komerčním výrobku. Toto množství je dostačující pro dvě potvrzující zkoušky.

2. 1. 2. 1 Vybavení
Podle rozsahu stanovení:
Nádoby: objem 3 - 25 litrů, např. dlouhohrdlé lahve nebo smaltované nádoby.
Míchačky: rychloběžná míchadla vrtulového nebo kuličkového typu.
Odsávací nálevky (Büchner): až do průměru 30 cm.
Odsávací baňky: až do objemu 20 litrů.
Dělící nálevky: až do objemu 20 litrů.
Destilační baňky: až do objemu 10 litrů.
Jímací baňky: až do objemu 10 litrů.
Porcelánové misky: o průměru okolo 20 cm.
Destilační kolony, chladiče, vodní lázně.

2. 1. 2. 2 Činidla
Destilovaná nebo demineralizovaná voda.
Isopropanol, čistý.
Uhličitan draselný (K₂CO₃), chemicky čistý.
Hydroxid draselný (KOH), 10 %-ní roztok.
Siřičitan sodný (Na₂SO₃), čistý, bezvodý.

2. 1. 2. 3 Postup

(i) Předběžná úprava
Pevné komerční výrobky: smísí se s destilovanou vodou (2. 1. 2. 4 (i)) na jemnou pastu za účelem rozrušení jakýchkoliv struktur přítomných v pastě (míchá se 10 minut). Na každých 10 g použité vody se přidá 60 g uhličitanu draselného a stále se míchá (10 minut) do rozpuštění.
Kapalné nebo polokapalné komerční výrobky: Upravují se v podstatě stejným způsobem jako pevné výrobky. Kapalný podíl odpařený na vodní lázni, který se stanoví předběžnou zkouškou na přibližně 10 g látky, se považuje za obsah vody, i když jsou zde přítomna těkavá organická rozpouštědla. Množství přidaného uhličitanu draselného bude záviset na obsahu vody, stanoveném, jak je uvedeno výše.
Kyselé suspenze nebo roztoky: neutralizují se přidáním 10%-ního roztoku hydroxidu draselného ještě před přidáním uhličitanu draselného.
Komerční výrobky obsahující volný chlor: odstraní se přídavkem siřičitanu sodného k vodné suspenzi nebo roztoku před neutralizací. Nadbytek siřičitanu sodného není škodlivý.

(ii) Extrakce
Přidá se isopropanol, směs se míchá po dobu 30 minut a zfiltruje se odsátím. Opakovaně se opláchne zbytek na filtru malým množstvím isopropanolu. Filtrát, který se musí v každém případě rozdělit do 2 vrstev v odsávací baňce, se spláchne pomocí isopropanolu do dělící baňky. Spodní vodná vrstva se odpustí a odstraní: vrchní isopropanolová vrstva se zfiltruje přes skládaný filtr do destilační baňky a poté pokud možno kvantitativně oddestiluje na vodní lázni (2. 1. 2. 4 (iii)). Destilační zbytky se převedou kvantitativně opláchnutím isopropanolem do porcelánové misky a na vodní lázni se obsah za častého míchání zahustí. Zahušťovací proces pokračuje tak dlouho, až následná dvě vážení v rozmezí 1 hodiny nevykazují rozdíl větší než 10 g. Extrakt se rozpustí ve vodě na vodní lázni a v tomto roztoku se stanoví obsah MBAS.
Potom
$\frac{g\mathrm{MBAS}v\mathrm{roztoku}\mathrm{extraktu}}{g\mathrm{MBAS}v\mathrm{komerčním}\mathrm{výrobku}}.100=\mathrm{extrakční}\mathrm{výtěžek}v\%$

2. 1. 2. 4 Poznámky
Při provádění extrakce je třeba vzít v úvahu:

(i) Rozdílnost komerčních výrobků je taková, že nelze specifikovat optimální relativní poměry vody a isopropanolu, které se mají použít při zkoušení daného výrobku, protože se mění případ od případu. Nicméně zkušenosti ukázaly, že potřebná množství vody jsou v následujících poměrech:
komerční výrobek (hm. díly): voda (obj. díly): isopropanol (obj. díly)
$1:\mathrm{0,5}-2:1-\mathrm{2,25}$
V podstatě však horní limity pro vodu a isopropanol neexistují.
Čím více látky má tendenci se shlukovat do suspenze, tím více je třeba přidat vody; vodu je třeba přidávat, dokud je při míchání na dně sediment.
Objem isopropanolu nemá být menší než uvádí následující vztah:
komerční výrobek: isopropanol = 1 : 1
Větší objem isopropanolu je třeba, jestliže obsah MBAS v komerčním výrobku značně přesáhne 10 %, nebo jestliže při míchání dojde k rychlému oddělení isopropanolové a vodné fáze.

(ii) Vodná fáze musí být nasycena uhličitanem draselným; malý nadbytek není škodlivý. Jestliže koncentrace uhličitanu draselného je příliš malá, pak se fáze buď neoddělí nebo isopropanolová fáze obsahuje příliš mnoho vody, což obojí má nežádoucí vliv na extrakční proces.

(iii) Isopropanolový destilát obsahuje vodu a musí být nasycen uhličitanem draselným; spodní vrstva, která se oddělí, musí být odstraněna. Isopropanol, který zůstal, může být použit pro čerstvou extrakci. Destiláty, získané při zkoušení kapalných komerčních výrobků se nesmí použít s ohledem na možnou přítomnost jiných rozpouštědel.

1. 2 SYNTETICKÁ ODPADNÍ VODA
Pro zkoušku se používá syntetická odpadní voda, připravovaná denně v množství 24 l roztoku, který v každém litru vodovodní vody obsahuje následující látky:
160 mg peptonu,
110 mg masového extraktu,
30 mg močoviny (CO(NH₂)₂),
7 mg chloridu sodného (NaCl),
4 mg chloridu vápenatého (CaCl₂.2H₂O),
2 mg síranu hořečnatého (MgSO₄.7H₂O)
20 ± 2 mg látky aktivní na methylenovou modř (MBAS)
MBAS se extrahuje ze zkoušeného výrobku postupem popsaným v kapitole (2. 1. 2). Syntetická odpadní voda se připravuje denně čerstvá.

2. 2 ODDĚLOVÁNÍ MÝDLA Z ISOPROPANOLU
Zkoušení biologické rozložitelnosti MBAS u komerčních výrobků může být zkresleno, i když se použije isopropanolový (IPA) extrakt. Křivky rozkladu snadno se rozkládajícího MBAS se pak mohou zdát podobné těm, které odpovídají nízké rozložitelnosti TBS. Před zkoušením rozložitelnosti MBAS je nutné oddělit z alkoholického extraktu rušivé mýdlo. Tento postup je určen k zabezpečení preparačního odstraňování dosti velkého množství mýdla z IPA extraktu. Získaný extrakt je používán jen pro zkoušení rozkladu MBAS a nesmí být použit pro další analytická stanovení a separace.
Obrázek 1

A. Zásobní nádoba
B. Dávkovací zařízení
C. Provzdušňovací komora
D. Usazovací nádoba
E. Mamutka
F. Sběrná nádoba
G. Provzdušňovač
H. Průtokoměr vzduchu
Obrázek 2

Obrázek 3
Výpočet biologické rozložitelnosti - Potvrzující zkouška

2. 2. 1 Princip oddělování mýdla
Dostatečné množství IPA extraktu k získání nejméně 25 g MBAS se rozpustí v methanolu. Roztok se okyselí kyselinou chlorovodíkovou, aby se uvolnily mastné kyseliny obsažené v mýdle. Po přidání vody v poměru 80 : 20 methanol/voda se mastné kyseliny extrahují petroléterem a extrakt se odstraní. Fáze methanol/voda se opět zalkalizuje a odpaří se do sucha.
Suchý zbytek se po stanovení obsahu MBASpoužije přímo pro zkoušku rozložitelnosti.

2. 2. 2 Postup
Ve 2litrové Erlenmayerově baňce se rozpustí za mírného zahřívání množství IPA extraktu obsahující nejméně 30 g MBAS v přibližně 100 ml methanolu. Po přidání celkem 800 ml methanolu se přidá 5 - 10 kapek roztoku bromfenolové modři (0,04%) a titruje se na pH 3 (žluté zabarvení) 2 M roztokem kyseliny chlorovodíkové. Po započtení objemu přidané kyseliny chlorovodíkové se doplní destilovanou vodou na celkový objem 1 litru.
Roztok bromfenolové modři: 0,4 g bromfenolové modři se rozpustí ve 200 ml 96%ního ethanolu a doplní se destilovanou vodou do 1 litru. Za účelem extrakce mastných kyselin se protřepe roztok v dělící nálevce odpovídající velikosti jednou s 300 ml a dvakrát s 200 ml n-hexanu. Je-li to nutné, může se extrakce provést v několika malých dělicích nálevkách. Když se objeví zakalené přechodné vrstvy, přidají se ke spodní fázi v prvních dvou extrakcích a k vrchní fázi poslední extrakce. Jestliže střední objem roztoku není dostačující pro rozpouštění a extrakci v případě velmi vysokého obsahu mýdla, může se použít odpovídajcí násobek.
n-hexanové frakce se spojí a promyjí se 200 ml směsi methanol-voda (80:20). Zakalené přechodné vrstvy se zachytí v n-hexanové fázi, která se odstraní.
Metanol-vodná fáze se spojí a titruje se na pH 9 1M roztokem hydroxidu sodného na fenolftalein. Roztok se zahušťuje na vodní lázni tak dlouho, až se metanol odpaří a extrakt se na vodní lázni znovu rozpustí ve vodě. Obsah MBAS tohoto roztoku se stanoví pomocí výše popsané metody.

1. 3 PŘÍPRAVA VZORKŮ

1. 3. 1 Základní výrobek, obsahující pouze MBAS, může být zkoušen v původním stavu. Pro přípavu zkušebního roztoku (M) musí být stanoven obsah MBAS

1. 3. 2 Kombinované výrobky se analyzují na obsah MBAS a mýdla. Musí se extrahovat alkoholem v souladu s následujícími podmínkami:

1. 3. 2. 1 Isopropanolová extrakce, jestliže vzorek obsahuje méně mýdla než MBAS (viz kapitola 2).

1. 3. 2. 2 Isopropanolová extrakce a odstranění mýdla, jestliže vzorek obsahuje více mýdla než MBAS (viz kapitola 2).
Pro přípravu zkušebních roztoků (M) musí být znám obsah MBAS v obou extraktech.

1. 4 ČINNOST ZAŘÍZENÍ
Provzdušňovací nádoba C a usazovací nádoba D se na počátku naplní syntetickou odpadní vodou. Výšku nádoby D je třeba nastavit tak, aby objem, obsažený v provzdušňovací nádobě C, byl 3 litry. Poté se uvede do provozu provzdušňovací zařízení G, mamutka E a dávkovací zařízení B. Syntetická odpadní voda musí protékat provzdušňovací nádobou C rychlostí jednoho litru za hodinu; z toho vyplývá střední doba zdržení 3 hodiny. Rychlost provzdušňování je nutné regulovat tak, aby obsah nádoby C byl neustále udržován v suspenzi a obsah rozpuštěného kyslíku činil nejméně 2 mg.l^-1. Pěnění je nutné předcházet vhodnými prostředky. Nesmějí se používat činidla proti pěnění, která inhibují aktivovaný kal nebo obsahují MBAS. Mamutku E je třeba nastavit tak, aby se aktivovaný kal z usazovací nádoby kontinuálně a pravidelně recykloval do provzdušňovací nádoby C. Kal, který se nashromáždí kolem horní části provzdušňovací nádoby C, na dně usazovací nádoby D nebo v cirkulačním okruhu, je nutné vracet do cirkulace nejméně jednou denně seškrabáním kartáčem nebo jiným vhodným způsobem. Pokud se kal neusazuje, je možné zvýšit jeho hustotu přídavky 2 ml dávek 5 % roztoku chloridu železitého, opakovaných podle potřeby.
Voda odtékající z usazovací nádoby D se shromažďuje v nádobě F po dobu 24 hodin, po této době se po důkladném promísení odebere vzorek.
Nádobu F je pak nutno pečlivě vyčistit.

1. 5 KONTROLA MĚŘÍCÍHO ZAŘÍZENÍ
Obsah MBAS (v mg.l^-1) v syntetické odpadní vodě se stanovuje bezprostředně před použitím.
Obsah MBAS (v mg.l^-1) v odtokové vodě, shromažďované po dobu 24 hodin v nádobě F, je třeba stanovovat analyticky stejnou metodou co nejdříve po shromáždění. Koncentrace musí být stanovena s přesností na 0,1 mg.l^-1 MBAS.
Pro kontrolu účinnosti probíhajícího procesu se nejméně dvakrát týdně ve filtrované syntetické odpadní vodě, stejně tak jako v odtokové vodě, shromažďované v nádobě F, změří chemická spotřeba kyslíku (CHSK). Úbytek CHSK se vyjadřuje v procentech.
Úbytek CHSK je ustálen, když se dosáhne přibližně pravidelného denního rozkladu MBAS, tzn. na konci záběhové doby, jak znázorňuje obrázek 3.
Ztráta žíháním sušiny aktivovaného kalu v provzdušňovací nádobě by měla být stanovena dvakrát týdně (v g.l^-1). Je-li hodnota vyšší než 2,5 mg.l^-1, nadbytečný aktivovaný kal musí být odstraněn.
Zkouška se provádí při pokojové teplotě; tato musí být stálá a nesmí klesnout pod 18 °C ani přesáhnout 30 °C.

1. 6 VÝPOČET BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI
Každý den se počítají procenta rozkladu MBAS na základě stanoveného obsahu MBAS v mg.l^-1 v syntetické odpadní vodě a odpovídající odtokové vodě, shromažďované v nádobě F.
Takto získané hodnoty rozkladu se znázorňují graficky jak je ukázáno na obrázku 3 (poznámka 1. 7. 2).
Rozložitelnost MBAS se vypočte jako aritmetický průměr hodnot, získaných během 21 dní, které následují po záběhové době, během nichž byl rozklad pravidelný a provoz zařízení bezporuchový. V žádném případě nemá trvání záběhové doby přesáhnout šest týdnů.

1. 7 POZNÁMKY

1. 7. 1 Při stanovení biologické rozložitelnosti zohledňují některé předpisy obsah mýdla.

1. 7. 2 V některých případech je možné připustit nižší frekvenci odběru vzorků, např. 1 vzorek za každé dva až tři dny, avšak pro výpočet průměrné hodnoty je třeba použít nejméně 14 výsledků, získaných během 21 dní následujících po záběhové době.