Příklad zkušební aparatury

XIII STANOVENÍ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI NEIONTOVÝCH POVRCHOVĚ AKTIVNÍCH LÁTEK
PŘEDBĚŽNÁ ÚPRAVA ZKOUŠENÝCH VZORKŮ
STANOVENÍ NEIONTOVÝCH POVRCHOVĚ AKTIVNÍCH LÁTEK V ROZTOCÍCH PŘI ZKOUŠCE BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI

1. 1 DEFINICE
Neiontové povrchově aktivní látky ve smyslu této směrnice jsou ty povrchově aktivní látky, které se po průchodu měniči kationtů a aniontů stanoví jako látky s aktivní reakcí s bismutem (bismuth - active substance, BiAS) v souladu s analytickým postupem popsaným v kapitole 3.

2. 1 ÚVODNÍ POZNÁMKY

2. 1. 1 Zpracování vzorků
Zpracování neiontových povrchově aktivních činidel a kombinovaných detergentů před stanovením biologické rozložitelnosti v potvrzujícím pokuse je následující:

Výrobky	Zpracování
Neiontové povrchově aktivní látky	Žádné
Kombinované detergenty	Extrakce alkoholem, následovaná separací neiontových povrchově aktivních látek na iontoměniči

Účelem extrakce alkoholem je odstranit nerozpustné a anorganické složky v komerčním výrobku, které by za určitých okolností mohly narušít zkoušky biologické rozložitelnosti.

2. 1. 2 Separace na iontoměniči
Pro správné provedení zkoušek biologické rozložitelnosti se vyžaduje izolace a separace neiontových povrchově aktivních látek od mýdla a aniontových a kationtových povrchově aktivních látek.
Toho se dosáhne pomocí iontoměniče typu makroporézní měničové pryskyřice a vhodných elučních činidel pro frakční eluci. Lze tak jedním postupem izolovat mýdlo a aniontové a neiontové povrchově aktivní látky.

2. 1. 3 Analytická kontrola
Po homogenizaci se stanoví koncentrace aniontových a neiontových povrchově aktivních látek v syntetickém detergentu analytickým postupem pomocí MBAS a BiAS. Obsah mýdla se stanoví vhodnou analytickou metodou.
Tato analýza výrobků je nutná pro výpočet množství, potřebných k přípravě frakcí pro zkoušky biologické rozložitelnosti.
Kvantitativní extrakce není nutná; je však třeba vyextrahovat nejméně 80 % neiontových povrchově aktivních látek. Obvykle se dosahuje 90 % a více.

3. 1 PRINCIP
Povrchově aktivní látky se zkoncentrují a izolují vypuzováním plynem. Množství neiontových povrchově aktivních látek v použitém vzorku by mělo být v rozmezí 250 - 800 µg.
Povrchově aktivní látka získaná vypuzením plynem se rozpustí v octanu etylnatém.
Po oddělení fází a odpaření rozpouštědla se neiontová povrchově aktivní látka vysráží z vodného roztoku modifikovaným Dragendorffovým činidlem (KBiJ₄ + BaCl₂+ ledová kyselina octová).
Sraženina se zfiltruje, promyje se ledovou kyselinou octovou a rozpustí se v roztoku vínanu amonného. Vismut v roztoku se ztitruje potenciometricky roztokem pyrrolidindithiokarbamátu při pH 4 - 5 s použitím hladké platinové indikační elektrody a kalomelové nebo stříbro/chloridostříbrné referenční elektrody.
Metodu lze použít pro neiontové povrchově aktivní látky obsahující 6 - 30 alkenoxidových skupin.
Spotřeba při titraci se pro přepočet na referenční látku, nonylfenol kondenzovaný s 10 moly etylenoxidu (NP 10), vynásobí empirickým faktorem 54.

1. 2 ZAŘÍZENÍ POTŘEBNÉ PRO MĚŘENÍ
Měřicí metoda používá malé zařízení zpracovávající aktivovaný kal, znázorněné na obr. 1 a podrobněji na obr. 2. Zařízení sestává ze zásobníku syntetické odpadní vody A, dávkovacího čerpadla B, provzdušňovací nádoby C, usazovací nádoby D, mamutky E pro recyklaci aktivovaného kalu a nádoby F pro shromažďování upravené odtokové vody.
Nádoby A a F musí být ze skla nebo z vhodného plastu o obsahu nejméně 24 litrů. Čerpadlo B musí zaručovat konstantní průtok syntetické odpadní vody do provzdušňovací nádoby; tato nádoba obsahuje za normálního provozu tři litry směsné kapaliny. Porézní provzdušňovací kostka G je ponořena v nádobě C u vrcholu kužele. Množství vzduchu prošlé provzdušňovačem se sleduje průtokoměrem H.

2. 2 PRINCIP
Z homogenního vzorku (prášky, vysušené pasty a odparek) se získá etanolový extrakt, který obsahuje povrchově aktivní látky, mýdlo a další složky vzorku detergentu, rozpustné v alkoholu.
Etanolový extrakt se odpaří na suchý zbytek, rozpustí ve směsi izopropanol/voda a získaný roztok se vede přes kombinaci silně kyselého katexu a makroporézního anexu, zahřátého na 323 K (50 °C). Tato vysoká teplota je nutná, aby se zabránilo vysrážení případných mastných kyselin, které mohou být přítomny v kyselém prostředí.
Neiontové povrchově aktivní látky se získají z odtokové vody odpařením.
Kationtové povrchově aktivní látky, které by mohly rušit zkoušku rozložitelnosti a analytický postup, se zachytí katexem, zařazeným před anexem.

3. 2 ČINIDLA A VYBAVENÍ
Pro přípravu činidel se používá deionizovaná voda.

3. 2. 1 Čistý octan etylnatý, čerstvě předestilovaný.

3. 2. 2 Hydrogenuhličitan sodný (NaHCO₃) p.a.

3. 2. 3 Zředěná kyselina chlorovodíková (20 ml koncentrované kyseliny (HCl) zředěné vodou na 1000 ml).

3. 2. 4 Methanol p.a., čerstvě předestilovaný, přechovávaný ve skleněné lahvi.

3. 2. 5 Bromkrezolová červeň, 0,1 g ve 100 ml ethanolu.

3. 2. 6 Srážecí činidlo: srážecí činidlo je směs dvou objemů roztoku A a jednoho objemu roztoku B. Směs se přechovává v hnědé lahvi a lze ji použít do jednoho týdne po smísení.

3. 2. 6. 1 Roztok A
1,7 g oxid dusičnanu oxidu bismutu p.a. (BiONO₃.H₂O) se rozpustí ve 20 ml ledové kyseliny octové a doplní se vodou na 100 ml. Dále se rozpustí 65 g jodidu draselného p.a. ve 200 ml vody. Tyto dva roztoky se smísí v 1000 ml odměrné baňce, přidá se 200 ml ledové kyseliny octové (3. 2. 7) a doplní se vodou na 1000 ml.

3. 2. 6. 2 Roztok B
290 g chloridu barnatého (BaCl₂.2H₂O) p.a. se rozpustí v 1000 ml vody.

3. 2. 7 Ledová kyselina octová 99 - 100 % (nižší koncentrace nejsou vhodné)

3. 2. 8 Roztok vínanu amonného: 12,4 g kyseliny vinné p.a. a 12,4 ml roztoku amoniaku p.a. (d = 0,910 g.ml^-1) se smísí a doplní vodou na 1000 ml (nebo se použije ekvivalentní množství vínanu amonného p.a.).

3. 2. 9 Zředěný roztok amoniaku: 40 ml roztoku amoniaku p.a. (d = 0,910 g.ml-1) se zředí vodou na 1000 ml.

3. 2. 10 Standardní tlumivý octanový roztok: 40 g tuhého hydroxidu sodného p.a. se rozpustí v kádince v 500 ml vody nechá zchladnout. Přidá se 120 ml ledové kyseliny octové (3. 2. 7). Důkladně se promíchá, ochladí a převede do 1000 ml odměrné baňky. Doplní se vodou po značku.

3. 2. 11 Roztok pyrrolidindithiokarbamátu (známý jako „karbátový roztok“): 103 mg pyrrolidindithiokarbamátu sodného (C₅H₈NNaS₂.2H₂O) se rozpustí v asi 500 ml vody, přidá se 100 ml n - amylalkoholu p.a. a 0,5 g NaHCO₃ p.a. a doplní se vodou na 1000 ml.

3. 2. 12 Roztok síranu měďnatého (pro standardizaci roztoku 3. 2. 11)
Zásobní roztok
1,249 g síranu měďnatého (CuSO₄.5H₂O) p.a. se smísí s 50 ml 0,5 M roztoku kyseliny sírové a doplní vodou na 1000 ml.
Standardní roztok
50 ml zásobního roztoku se smísí s 10 ml 0,5 M roztoku H₂SO₄ a doplní se vodou na 1000 ml.

3. 2. 13 Chlorid sodný p.a.

3. 2. 14 Přístroj pro stripování plynem (viz obr. 5)
Průměr porézního (fritového) kotouče musí být stejný jako vnitřní průměr válce.

3. 2. 15 Dělící nálevka 250 ml

3. 2. 16 Magnetické míchadlo s magnetem 25 - 30 mm.

3. 2. 17 Goochův kelímek, průměr perforovaného dna = 25 mm, typ G 4.

3. 2. 18 Kruhové papírové filtry se skelným vláknem o průměru 27 mm s průměrem vlákna 0,5 - 1,5 µm.

3. 2. 19 Dvě filtrační baňky s adaptéry a pryžovými manžetami, 500 a 250 ml.

3. 2. 20 Registrační potenciometr, vybavený hladkou platinovou indikační elektrodou a kalomelovou nebo sříbro/chloridostříbrnou referenční elektrodou o rozsahu 250 mV, s automatickou byretou o objemu 20 - 25 ml, nebo odpovídajícím zařízením s ruční obsluhou.

1. 3 SYNTETICKÁ ODPADNÍ VODA
Pro zkoušku se používá syntetická odpadní voda. V jednom litru vodovodní vody se rozpustí:
160 mg peptonu,
110 mg masového extraktu,
30 mg močoviny (CO(NH₂)₂),
7 mg chloridu sodného (NaCl),
4 mg chloridu vápenatého (CaCl₂.2H₂O),
2 mg síranu hořečnatého (MgSO₄.7H₂O)
28 mg hydrogenfosforečnanu draselného (K₂HPO₄) a 10 ± 1 mg BiAS.
BiAS se extrahuje ze zkoušeného výrobku metodou uvedenou v kapitole 2. Syntetická odpadní voda se připravuje denně čerstvá.

2. 3 ČINIDLA A VYBAVENÍ

2. 3. 1 Deionizovaná voda.

2. 3. 2 Etanol, 95% (obj.) C₂H₅OH
(povolené denaturační prostředky: methylethylketon nebo metanol).

2. 3. 3 Směs izopropanol/voda (50/50 obj.):
50 obj. dílů izopropanolu (CH₃CHOH.CH₃) a 50 obj. dílů vody (2. 3. 1).

2. 3. 4 Roztok hydrogenuhličitanu amonného (60/40 obj.):
0,3 mol NH₄HCO₃ v 1000 ml směsi izopropanol/voda, tvořené 60 obj. díly izopropanolu a 40 obj. díly vody (2. 3. 1).

2. 3. 5 Katex (KAT), silně kyselý, odolný vůči alkoholu (50 - 100 mesh).

2. 3. 6 Anex (AAT), makroporézní, Merck Lewatit MP 7080 (70 - 150 mesh) nebo ekvivalentní.

2. 3. 7 Kyselina chlorovodíková, 10 % HCl (hm.).

2. 3. 8 2000 ml baňka s kulatým dnem se zabroušenou zátkou a zpětným chladičem.

2. 3. 9 Vakuový filtr (ohřívatelný) o průměru 90 mm na filtrační papíry.

2. 3. 10 2000 ml filtrační baňka.

2. 3. 11 Ionexové kolony s ohřívacím pláštěm a kohoutkem; vnitřní trubice průměru 60 mm a výšky 450 mm (obr. 4).

2. 3. 12 Vodní lázeň.

2. 3. 13 Vakuová sušárna.

2. 3. 14 Termostat.

2. 3. 15 Rotační odparka.

3. 3 METODA

3. 3. 1 Koncentrace a separace povrchově aktivní látky
Vodný roztok se zfiltruje přes jakostní filtrační papír. Prvních 100 ml filtrátu se vyleje.
Odměřené množství vzorku, které obsahuje 250 - 800 µg neiontové povrchově aktivní látky, se převede do stripovacího přístroje, který byl předtím promyt octanem etylnatým.
Pro zlepšení separace se přidá 100 g chloridu sodného a 5 g hydrogenuhličitanu sodného.
Je-li objem vzorku větší než 500 ml, přidají se tyto soli do stripovacího přístroje v tuhé formě, a rozpustí se probubláním dusíkem nebo vzduchem.
Použije-li se vzorek o menším objemu, rozpustí se tyto soli ve 400 ml vody a pak se přidají do stripovacího přístroje.
Přidá se voda tak, aby hladina dosáhla k hornímu uzavíracímu kohoutu.
Na vodní hladinu se opatrně přidá 100 ml octanu etylnatého.
Promývačka v části pro plyn (dusík nebo vzduch) se naplní do dvou třetin octanem etylnatým.
Přístrojem se nechá procházet plyn průtokovou rychlostí 30 - 60 l.h^-1; doporučuje se zapojení rotačního průtokoměru. Intenzita provzdušňování se musí na počátku zvyšovat postupně. Rychlost průtoku plynu je nutné nastavit tak, aby fáze zůstaly znatelně odděleny z důvodu minimalizace míšení fází a rozpouštění octanu etylnatého ve vodě. Po pěti minutách se průtok plynu zastaví.
Dojde-li k úbytku organické fáze rozpuštěním ve vodě většímu než 20%, je nutno postup opakovat se zvláštní pozorností na rychlost probublání plynu.
Organická fáze se slije do dělící nálevky. Případná voda v dělící nálevce z vodné fáze, které by mělo být jen několik ml, se vrátí do stripovacího přístroje. Fáze octanu etylnatého se zfiltruje přes suchý jakostní filtrační papír do 250 ml kádinky.
Do stripovacího přístroje se přidá dalších 100 ml octanu etylnatého a znovu se nechá procházet dusík nebo vzduch po dobu pěti minut. Poté se organická fáze přepraví do dělící nálevky, použité při prvním dělení, vodná fáze se odstraní a organická fáze se zfiltruje přes týž filtr jako první podíl octanu etylnatého. Dělicí nálevka i filtr se propláchnou asi 20 ml octanu etylnatého.
Etylacetátový extrakt se na vodní lázni odpaří do sucha (v digestoři). Pro urychlení odpařování se na hladinu roztoku zavede jemný proud vzduchu.

3. 3. 2 Srážení a filtrace
Suchý odparek dle 3. 3. 1 se rozpustí v 5 ml metanolu, přidá se 40 ml vody a 0,5 ml zředěného roztoku HCl (3. 2. 3), a směs se promíchá magnetickým míchadlem.
K tomuto roztoku se z odměrného válce přidá 30 ml srážecího činidla (3. 2. 6). Sraženina se vytvoří po opakovaném míchání. Po 10 minutách míchání se směs nechá nejméně pět minut stát.
Směs se zfiltruje přes Goochův kelímek, na jehož dno se položí filtrační papír ze skelných vláken. Nejdříve se filtr promyje za odsávání asi 2 ml ledové kyseliny octové. Poté se pečlivě omyjí kádinka, magnet a kelímek ledovou kyselinou octovou, jíž je třeba asi 40 - 50 ml. Sraženinu ulpělou na stěnách kádinky není nutné převést na filtr kvantitativně, protože roztok sraženiny se pro titraci vrátí do srážecí kádinky a zbývající sraženina se pak rozpustí.

3. 3. 3 Rozpuštění sraženiny
Sraženina ve filtračním kelímku se rozpustí v horkém roztoku vinanu amonného (asi 80 °C, 353 K) (3. 2. 8), který se přidává ve třech dávkách po 10 ml. Každá dávka se před odsátím filtrem do baňky nechá několik minut stát v kelímku.
Obsah filtrační baňky se převede do kádinky použité ke srážení. Stěny kádinky se opláchnou dalšími 20 ml roztoku vinanu, aby se rozpustil zbytek sraženiny.
Kelímek, adaptér a filtrační baňka se pečlivě opláchnou 150 - 200 ml vody a tato voda se vrátí do kádinky použité pro srážení.

3. 3. 4 Titrace
Roztok se promíchá magnetickým míchadlem (3. 2. 16), přidá se několik kapek bromkrezolové červeni (3. 2. 5) a přidává se zředěný roztok amoniaku (3. 2. 9), až se zbarvení změní na fialové (roztok je mírně kyselý přítomností zbytku kyseliny octové použité k promytí).
Pak se přidá 10 ml standardního tlumivého octanového roztoku (3. 2. 10), elektrody se ponoří do roztoku a potenciometricky se titruje standardním „karbátovým roztokem“, přičemž ústí byrety je ponořeno do roztoku.
Rychlost titrace nesmí přesáhnout 2 ml.min^-1.
Bod ekvivalence je průsečíkem tečen obou větví křivky potenciálu. Někdy se pozoruje plochý průběh inflexe křivky potenciálu; tomu je možné se vyhnout pečlivým očištěním platinové elektrody (vyleštěním smirkovým papírem).

3. 3. 5 Slepá stanovení
Souběžně s celým postupem se provádí slepé stanovení s 5 ml metanolu a 40 ml vody podle návodu uvedeného v bodě 3. 3. 2. Spotřeba při slepé titraci musí být nižší než 1 ml, jinak je podezření na nedostatečnou čistotu činidel (3. 2. 3 - 3. 2. 7 - 3. 2. 8 - 3. 2. 9 - 3. 2. 10), zejména na jejich obsah těžkých kovů, a je nutno je vyměnit. Slepé stanovení je nutné vzít v úvahu při výpočtu výsledků.

3. 3. 6 Kontrola faktoru „karbátového roztoku“
Faktor karbátového roztoku se stanoví v den použití. Po přidání 100 ml vody a 10 ml standardního octanového tlumivého roztoku (3. 2. 10) se ztitruje 10 ml roztoku síranu měďnatého (3. 2. 12) karbátovým roztokem. Je-li spotřeba „a“ ml, je faktor f:
$f=\frac{10}{a}$
a všechny výsledky titrací se násobí tímto činitelem.

1. 4 PŘÍPRAVA VZORKŮ

1. 4. 1 Nesmíchané povrchově aktivní látky je možné zkoušet v původním stavu. Za účelem přípravy syntetické odpadní vody (1.3) musí být stanoven obsah BiAS.

1. 4. 2 Kombinované výrobky se analyzují na obsah BiAS, MBAS a mýdla. Musí se extrahovat alkoholem a separovat BiAS (viz kapitolu 2). Obsah BiAS v extraktu je nutné znát k přípravě syntetické odpadní vody.

2. 4 PŘÍPRAVA EXTRAKTU A SEPARACE NEIONTOVÝCH AKTIVNÍCH LÁTEK

2. 4. 1 Příprava extraktu
Množství povrchově aktivních látek, potřebných pro zkoušku rozložitelnosti, je asi 25 g BiAS.
Při přípravě extraktů pro zkoušky rozložitelnosti je třeba použité množství výrobku omezit nejvýše na 2000 g. Za účelem získání dostatečného množství vzorku pro zkoušky může být nezbytné provádět postup dvakrát nebo vícekrát. Zkušenost ukázala, že je výhodné používat větší počet malých extrakcí než jednu velkou.

2. 4. 2 Izolace složek rozpustných v alkoholu
250 g analyzovaného syntetického detergentu se přidá k 1250 ml etanolu, směs se zahřeje k bodu varu a za míchání se vaří pod zpětným chladičem po dobu 1 hodiny. Horký alkoholický roztok se odsaje přes hrubý porézní vakuový filtr zahřátý na 323 K (50 °C), a rychle se zfiltruje. Baňka a vakuový filtr se promyjí přiibližně 200 ml horkého etanolu. Filtrát a etanol z promytí filtru se ve filtrační baňce spojí.
V případě analýz past nebo kapalných výrobků je třeba se přesvědčit, že ve vzorku není obsaženo více než 25 g aniontové povrchově aktivní látky a 35 g mýdla. Tento odvážený vzorek se odpaří do sucha. Odparek se rozpustí v 500 ml etanolu a postupuje se výše popsaným způsobem.
V případě prášků o nízké sypné hustotě (< 300 g.l^-1 ) se doporučuje zvýšit podíl etanolu na poměr 20:1.
Etanolový filtrát se odpaří do sucha, nejlépe v rotační odparce. Je-li třeba většího množství extraktu, postup se opakuje. Odparek se rozpustí v 5000 ml směsi izopropanol/voda.

2. 4. 3 Příprava ionexových kolon
Katexová kolona
600 ml katexové pryskyřice (2. 3. 5) se nasype do 3000 ml kádinky a přidá se 2000 ml kyseliny chlorovodíkové (2. 3. 7). Nechá se stát nejméně dvě hodiny za občasného promíchání. Kyselina se sleje a pomocí deionizované vody se pryskyřice převede do kolony (2. 3. 11). V koloně musí být zátka ze skelné vaty. Kolona se promývá deionizovanou vodou rychlostí 10 - 30 ml.min^-1, až je eluát prostý chloridů. Voda se nahradí 2000 ml směsi izopropanol/voda (2. 3. 3) rychlostí 10 - 30 ml.min^-1. Tím je ionexová kolona připravena k provozu.
Anexová kolona
600 ml anexové pryskyřice (2. 3. 6) se nasype do kádinky a přidá se 2000 ml deionizované vody. Pryskyřice se nechá nejméně dvě hodiny botnat. Poté se převede pomocí deionizované vody do kolony. V koloně musí být zátka ze skelné vaty.
Kolona se promyje 0,3 M roztokem hydrogenuhličitanu amonného (2. 3. 4), až je prostá chloridů. K tomu je třeba asi 5000 ml roztoku. Znovu se promyje 2000 ml deionizované vody. Voda se nahradí 2000 ml směsi izopropanol/voda (2. 3. 3) rychlostí 10 - 30 ml.min^-1. Tím je ionexová kolona ve formě OH připravena k provozu.

2. 4. 4 Ionexová separace
Ionexové kolony se spojí tak, aby katexová kolona byla umístěna nad anexovou kolonou. Kolony se zahřejí na 323 K (50 °C) s použitím termostatické kontroly. 5000 ml roztoku, získaného v bodě 2. 4. 2, se zahřeje na 333 K (60 °C) a vede se kombinací kolon rychlostí 20 ml.min^-1. Kolony se promyjí 1000 ml horké směsi izopropanol/voda (2. 3. 3).
Pro získání neiontových povrchově aktivních látek se spojí filtrát a roztoky z promývání filtru a odpaří se do sucha, nejlépe v rotační odparce. Odparek obsahuje BiAS. Přidá se deionizovaná voda až do získání určeného objemu, a v alikvotní části se stanoví obsah BiAS, jak je uvedeno v kapitole 3. 3. Roztok se použije jako standardní roztok neiontových syntetických detergentů pro zkoušku rozložitelnosti. Roztok je nutno přechovávat při teplotě pod 278 K (5 °C).

2. 4. 5 Regenerace iontoměničových pryskyřic
Katex se po použití odstraní.
Anex se regeneruje promytím asi 5000 - 6000 ml roztoku hydrogenuhličitanu amonného (2. 3. 4) průtokovou rychlostí přibližně 10 ml.min^-1, až je eluát prostý aniontových povrchově aktivních látek (test s metylenovou modří). Poté se anex promyje 2000 ml směsi izopropanol/voda (2. 3. 3). Anex je opět připraven k provozu.

3. 4 VÝPOČET VÝSLEDKŮ
Každá neiontová povrchově aktivní látka má svůj vlastní faktor, závislý na jejím složení, zejména na délce alkenoxidového řetězce. Koncentrace neiontové povrchově aktivní látky se vyjadřuje ve vztahu ke standardní látce - nonylfenolu s 10 etylenoxidovými jednotkami (NP 10) - pro který je přepočítavací faktor 0,054.
S použitím tohoto faktoru se zjistí množství povrchově aktivní látky, přítomné ve vzorku, vyjádřené v mg ekvivalentu NP 10:
(b - c). f. 0,054 = mg neiontové povrchově aktivní látky jako NP 10
kde
b = objem „karbátového roztoku“, spotřebovaného u vzorku (ml),
c = objem „karbátového roztoku“, spotřebovaného při slepém stanovení (ml),
f = faktor „karbátového roztoku“.

1. 5 POPIS ČINNOSTI ZAŘIZENÍ
Nejdříve se naplní provzdušňovací nádoba C a usazovací nádoba D syntetickou odpadní vodou. Výšku nádoby D je třeba nastavit tak, aby objem, obsažený v provzdušňovací nádobě C, odpovídal 3 litrům. Naočkování se provede přidáním 3 ml sekundárně vyčištěné opadní vody dobré kvality, čerstvě odebrané z čistírny pracující převážně s domovní odpadní vodou. Upravenou odpadní vodu je nutno v období mezi odběrem a použitím přechovávat v aerobních podmínkách. Poté se uvede do provozu provzdušňovací zařízení G, mamutka E a dávkovací zařízení B. Syntetická odpadní voda musí protékat provzdušňovací nádobou C rychlostí jednoho litru za hodinu; z toho vyplývá střední doba zdržení 3 hodiny.
Rychlost provzdušňování je nutné regulovat tak, aby obsah nádoby C byl neustále udržován v suspenzi a obsah rozpuštěného kyslíku činil nejméně 2 mg.l^-1. Pěnění je nutné předcházet vhodnými prostředky. Nesmějí se používat činidla proti pěnění, která inhibují aktivovaný kal nebo obsahují BiAS. Mamutku E je třeba nastavit tak, aby se aktivovaný kal z usazovací nádoby kontinuálně a rovnoměrně recykloval do provzdušňovací nádoby C, kal na dně usazovací nádoby D nebo v cirkulačním okruhu, musí být vrácen do cirkulace nejméně jednou denně seškrabáním kartáčem nebo jiným vhodným způsobem. Pokud se kal neusazuje, je možno zvýšit jeho schopnost usazování přídavky 2 ml 5% roztoku chloridu železitého, opakovanými podle potřeby.
Upravená voda, odtékající z usazovací nádoby D, se shromažďuje v nádobě F po dobu 24 hodin, poté se po důkladném promísení odebere vzorek. Nádobu F je pak nutné pečlivě vyčistit.

3. 5 VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ
Výsledky se vyjádří v mg.l^-1 jako NP 10 zaokrouhleně na nejbližší 0,1.
Obrázek 1

A. Zásobní nádoba
B. Dávkovací zařízení
C. Provzdušňovací komora
D. Usazovací nádoba
E. Mamutka
F. Sběrná nádoba
G. Provzdušňovač
H. Průtokoměr vzduchu
Obrázek 2

Obrázek 3
Výpočet biologické rozložitelnosti - Potvrzující zkouška

Obrázek 4
Vyhřívaná ionexová kolona

(Rozměry v milimetrech)
Obrázek 5
Zařízení pro stripování plynem

(Rozměry v milimetrech)

1. 6 KONTROLA MĚŘICÍHO ZAŘÍZENÍ
Obsah BiAS (v mg.l^-1) v syntetické odpadní vodě se stanoví bezprostředně před použitím.
Obsah BiAS (v mg.l^-1) ve vodě, shromažďované po dobu 24 hodin v nádobě F, je třeba stanovit analyticky stejnou metodou ihned po shromáždění; jinak se musí vzorky uchovávat, nejlépe zmrazené.
Koncentrace se musí stanovit s přesností na 0,1 mg.l^-1 BiAS.
Pro kontrolu účinnosti probíhajícího procesu se nejméně dvakrát týdně měří v odtékající vodě, zfiltrované přes skelnou vatu a shromažďované v nádobě F, a dále i ve zfiltrované syntetické odpadní vodě v nádobě A, chemická spotřeba kyslíku (CHSK) nebo obsah rozpuštěného organického uhlíku (DOC).
Úbytek CHSK nebo DOC je ustálen, když se dosáhne přibližně pravidelný denní biologický rozklad BiAS na konci záběhové doby, znázorněné na obr. 3.
Obsah sušiny v aktivovaném kalu obsaženém v provzdušňovací nádobě, je nutné stanovovat dvakrát týdně v g.l^-1. Činí-li více než 2,5 g.l^-1, musí bý t nadbytečný aktivovaný kal odstraněn.
Zkouška rozkladu se provádí při pokojové teplotě; ta musí být stálá a musí se udržovat mezi 292 a 297 K (19 - 24 °C).

1. 7 VÝPOČET BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI
Výpočet procenta biologického rozkladu BiAS se musí provádět denně na základě obsahu BiAS v mg.l^-1 v syntetické odpadní vodě a odpovídající odtokové vodě, shromažďované v nádobě F.
Takto získané hodnoty rozkladu se znázorňují graficky, jak je ukázané na obr. 3.
Rozklad BiAS se vypočte jako aritmetický průměr hodnot, získlaných během 21 dní následujících po záběhové době, během níž byl rozklad pravidelný a provoz zařízení bezporuchový. V žádném případě nemá trvání záběhové doby přesáhnout šest týdnů.
Denní hodnoty rozkladu se počítají s přesností na 0,1 %, ale konečný výsledek se udává zaokrouhleně na nejbližší celé číslo.
V některých případech je možné připustit nižší frekvenci odběru vzorků, avšak pro výpočet průměrné hodnoty je třeba použít nejméně 14 výsledků, získaných během 21 dní, následujících po záběhové době.

XIV STANOVENÍ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI ANIONTOVÝCH POVRCHOVĚ AKTIVNÍCH LÁTEK
PŘEDBĚŽNÁ ÚPRAVA ZKOUŠENÝCH VÝROBKŮ

1. 1 ZAŘÍZENÍ POTŘEBNÉ PRO MĚŘENÍ
Měřicí metoda používá malé zařízení zpracovávající aktivovaný kal, znázorněné na obrázku 1 a podrobněji na obrázku 2.
Zařízení sestává ze zásobníku syntetické odpadní vody A, dávkovacího čerpadla B, provzdušňovací nádoby C, usazovací nádoby D, mamutky E pro recyklaci aktivovaného kalu a nádoby F pro shromažďování upravené odtokové vody.
Nádoby A a F musí být ze skla nebo z vhodného plastu o obsahu nejméně 24 litrů. Čerpadlo B musí zaručovat konstantní průtok syntetické odpadní vody do provzdušňovací nádoby; tato n ádoba obsahuje za normálního provozu tři litry směsné kapaliny. Porézní provzdušňovací kostka G je ponořena v nádobě C u vrcholu kužele. Množství vzduchu prošlé provzdušňovačem se sleduje průtokoměrem H.

2. 1 ALKOHOLICKÝ EXTRAKT
Účelem extrakce je oddělit z komerčního výrobku nerozpustné a anorganické složky, které by mohly za určitých podmínek narušit zkoušky biologické rozložitelnosti.
Kvantitativní oddělení těchto složek není nutné, není nutná ani kvantitativní extrakce aktivních složek. Je však třeba, aby nejméně 90 % složek aktivních k methylenové modři, z výrobku, který má být zkoušen, bylo zkoncentrováno v extraktu.
Pro přípravu alkoholových extraktů jsou vhodné dvě metody, jedna používající ethanol a druhá používající izopropanol. Izopropanolová metoda je zvláště vhodná, jestliže se jedná o velká množství materiálu, jak vyžaduje potvrzující zkouška.

2. 1. 1 Ethanolový extrakt

2. 1. 1. 1 Příprava vzorků

(i) Prášky
Připraví se přibližně 250 g vzorku buď kvartováním nebo podle Doporučení ISO č. 607.
Vzorek se rozdrtí na domácím rotačním mlýnku tak, aby výsledné částice prachu nebyly větší než 250 mikronů.
Prášek se opatrně promísí a uloží do vhodného obalu.

(ii) Kapaliny
Odváží se asi 40 g homogenizované látky s přesností na 1 g a přenese se do baňky s kulatým dnem, popsané v 2. 1. 1. 2 (iii) níže.
Přidá se 50 ml ethanolu (2. 1. 1. 2 (ii) a odpařuje se na vodní lázni do sucha za současného odsávání těkavých zplodin tak dlouho, až dvě následná vážení se neliší více než o 0,1 g. K vážení může být použita jakákoliv váha s přesností 0,01 g.

2. 1. 1. 2 Příprava roztoku v ethanolu

(i) Princip
Ethanolová extrakce dostatečného množství látky pro stanovení obsahu mýdla nebo jiných aniontů nebo pro biologické zkoušky.

(ii) Činidlo
95 % - 96 % ethanol.

(iii) Vybavení
Běžné laboratorní vybavení, které obsahuje především:
baňku objemu 1 l s kulatým dnem, krátkým hrdlem a zábrusem 29/32;
vertikální chladič se zábrusem 29/ 32 o délce 400 mm;
fritový filtr 10 - 20 mikronů;
odměrnou baňku o objemu 1 l.

2. 1. 1. 3 Postup
Známá navážka E (tj. 40 g ± 1 g) látky (2. 1. 1. 1 (i)) se nasype do 1 litrové baňky nebo se použije suchý extrakt, připravený dle 2. 1. 1. 1 (ii).
Přidá se 500 ml ethanolu (2. 1. 1. 2 (ii)), připojí se chladič a vaří se po dobu 15 minut. Poté se dekantuje kapalná vrstva a horká se odsaje přes fritový filtr. Tento postup se aplikuje na zbytky v baňce 2 x, k čemuž se použije dvou dávek po 200 ml ethanolu. Extrakty se spojí kvantitativně s oplachy filtru v odměrné baňce, doplní do 1 litru ethanolem a opatrně se promísí.

2. 1. 2 Isopropanolový extrakt
Potřebné množství, které odpovídá asi 50 g MBAS v extraktu, se vypočítá z obsahu MBAS v komerčním výrobku. Toto množství je dostačující pro dvě potvrzující zkoušky.

2. 1. 2. 1 Vybavení
Podle rozsahu stanovení:
Nádoby: objem 3 - 25 litrů, např. dlouhohrdlé lahve nebo smaltované nádoby.
Míchačky: rychloběžná míchadla vrtulového nebo kuličkového typu.
Odsávací nálevky (Büchner): až do průměru 30 cm.
Odsávací baňky: až do objemu 20 litrů.
Dělící nálevky: až do objemu 20 litrů.
Destilační baňky: až do objemu 10 litrů.
Jímací baňky: až do objemu 10 litrů.
Porcelánové misky: o průměru okolo 20 cm.
Destilační kolony, chladiče, vodní lázně.

2. 1. 2. 2 Činidla
Destilovaná nebo demineralizovaná voda.
Isopropanol, čistý.
Uhličitan draselný (K₂CO₃), chemicky čistý.
Hydroxid draselný (KOH), 10 %-ní roztok.
Siřičitan sodný (Na₂SO₃), čistý, bezvodý.

2. 1. 2. 3 Postup

(i) Předběžná úprava
Pevné komerční výrobky: smísí se s destilovanou vodou (2. 1. 2. 4 (i)) na jemnou pastu za účelem rozrušení jakýchkoliv struktur přítomných v pastě (míchá se 10 minut). Na každých 10 g použité vody se přidá 60 g uhličitanu draselného a stále se míchá (10 minut) do rozpuštění.
Kapalné nebo polokapalné komerční výrobky: Upravují se v podstatě stejným způsobem jako pevné výrobky. Kapalný podíl odpařený na vodní lázni, který se stanoví předběžnou zkouškou na přibližně 10 g látky, se považuje za obsah vody, i když jsou zde přítomna těkavá organická rozpouštědla. Množství přidaného uhličitanu draselného bude záviset na obsahu vody, stanoveném, jak je uvedeno výše.
Kyselé suspenze nebo roztoky: neutralizují se přidáním 10%-ního roztoku hydroxidu draselného ještě před přidáním uhličitanu draselného.
Komerční výrobky obsahující volný chlor: odstraní se přídavkem siřičitanu sodného k vodné suspenzi nebo roztoku před neutralizací. Nadbytek siřičitanu sodného není škodlivý.

(ii) Extrakce
Přidá se isopropanol, směs se míchá po dobu 30 minut a zfiltruje se odsátím. Opakovaně se opláchne zbytek na filtru malým množstvím isopropanolu. Filtrát, který se musí v každém případě rozdělit do 2 vrstev v odsávací baňce, se spláchne pomocí isopropanolu do dělící baňky. Spodní vodná vrstva se odpustí a odstraní: vrchní isopropanolová vrstva se zfiltruje přes skládaný filtr do destilační baňky a poté pokud možno kvantitativně oddestiluje na vodní lázni (2. 1. 2. 4 (iii)). Destilační zbytky se převedou kvantitativně opláchnutím isopropanolem do porcelánové misky a na vodní lázni se obsah za častého míchání zahustí. Zahušťovací proces pokračuje tak dlouho, až následná dvě vážení v rozmezí 1 hodiny nevykazují rozdíl větší než 10 g. Extrakt se rozpustí ve vodě na vodní lázni a v tomto roztoku se stanoví obsah MBAS.
Potom
$\frac{g\mathrm{MBAS}v\mathrm{roztoku}\mathrm{extraktu}}{g\mathrm{MBAS}v\mathrm{komerčním}\mathrm{výrobku}}.100=\mathrm{extrakční}\mathrm{výtěžek}v\%$

2. 1. 2. 4 Poznámky
Při provádění extrakce je třeba vzít v úvahu:

(i) Rozdílnost komerčních výrobků je taková, že nelze specifikovat optimální relativní poměry vody a isopropanolu, které se mají použít při zkoušení daného výrobku, protože se mění případ od případu. Nicméně zkušenosti ukázaly, že potřebná množství vody jsou v následujících poměrech:
komerční výrobek (hm. díly): voda (obj. díly): isopropanol (obj. díly)
$1:\mathrm{0,5}-2:1-\mathrm{2,25}$
V podstatě však horní limity pro vodu a isopropanol neexistují.
Čím více látky má tendenci se shlukovat do suspenze, tím více je třeba přidat vody; vodu je třeba přidávat, dokud je při míchání na dně sediment.
Objem isopropanolu nemá být menší než uvádí následující vztah:
komerční výrobek: isopropanol = 1 : 1
Větší objem isopropanolu je třeba, jestliže obsah MBAS v komerčním výrobku značně přesáhne 10 %, nebo jestliže při míchání dojde k rychlému oddělení isopropanolové a vodné fáze.

(ii) Vodná fáze musí být nasycena uhličitanem draselným; malý nadbytek není škodlivý. Jestliže koncentrace uhličitanu draselného je příliš malá, pak se fáze buď neoddělí nebo isopropanolová fáze obsahuje příliš mnoho vody, což obojí má nežádoucí vliv na extrakční proces.

(iii) Isopropanolový destilát obsahuje vodu a musí být nasycen uhličitanem draselným; spodní vrstva, která se oddělí, musí být odstraněna. Isopropanol, který zůstal, může být použit pro čerstvou extrakci. Destiláty, získané při zkoušení kapalných komerčních výrobků se nesmí použít s ohledem na možnou přítomnost jiných rozpouštědel.

1. 2 SYNTETICKÁ ODPADNÍ VODA
Pro zkoušku se používá syntetická odpadní voda, připravovaná denně v množství 24 l roztoku, který v každém litru vodovodní vody obsahuje následující látky:
160 mg peptonu,
110 mg masového extraktu,
30 mg močoviny (CO(NH₂)₂),
7 mg chloridu sodného (NaCl),
4 mg chloridu vápenatého (CaCl₂.2H₂O),
2 mg síranu hořečnatého (MgSO₄.7H₂O)
20 ± 2 mg látky aktivní na methylenovou modř (MBAS)
MBAS se extrahuje ze zkoušeného výrobku postupem popsaným v kapitole (2. 1. 2). Syntetická odpadní voda se připravuje denně čerstvá.

2. 2 ODDĚLOVÁNÍ MÝDLA Z ISOPROPANOLU
Zkoušení biologické rozložitelnosti MBAS u komerčních výrobků může být zkresleno, i když se použije isopropanolový (IPA) extrakt. Křivky rozkladu snadno se rozkládajícího MBAS se pak mohou zdát podobné těm, které odpovídají nízké rozložitelnosti TBS. Před zkoušením rozložitelnosti MBAS je nutné oddělit z alkoholického extraktu rušivé mýdlo. Tento postup je určen k zabezpečení preparačního odstraňování dosti velkého množství mýdla z IPA extraktu. Získaný extrakt je používán jen pro zkoušení rozkladu MBAS a nesmí být použit pro další analytická stanovení a separace.
Obrázek 1

A. Zásobní nádoba
B. Dávkovací zařízení
C. Provzdušňovací komora
D. Usazovací nádoba
E. Mamutka
F. Sběrná nádoba
G. Provzdušňovač
H. Průtokoměr vzduchu
Obrázek 2

Obrázek 3
Výpočet biologické rozložitelnosti - Potvrzující zkouška

2. 2. 1 Princip oddělování mýdla
Dostatečné množství IPA extraktu k získání nejméně 25 g MBAS se rozpustí v methanolu. Roztok se okyselí kyselinou chlorovodíkovou, aby se uvolnily mastné kyseliny obsažené v mýdle. Po přidání vody v poměru 80 : 20 methanol/voda se mastné kyseliny extrahují petroléterem a extrakt se odstraní. Fáze methanol/voda se opět zalkalizuje a odpaří se do sucha.
Suchý zbytek se po stanovení obsahu MBASpoužije přímo pro zkoušku rozložitelnosti.

2. 2. 2 Postup
Ve 2litrové Erlenmayerově baňce se rozpustí za mírného zahřívání množství IPA extraktu obsahující nejméně 30 g MBAS v přibližně 100 ml methanolu. Po přidání celkem 800 ml methanolu se přidá 5 - 10 kapek roztoku bromfenolové modři (0,04%) a titruje se na pH 3 (žluté zabarvení) 2 M roztokem kyseliny chlorovodíkové. Po započtení objemu přidané kyseliny chlorovodíkové se doplní destilovanou vodou na celkový objem 1 litru.
Roztok bromfenolové modři: 0,4 g bromfenolové modři se rozpustí ve 200 ml 96%ního ethanolu a doplní se destilovanou vodou do 1 litru. Za účelem extrakce mastných kyselin se protřepe roztok v dělící nálevce odpovídající velikosti jednou s 300 ml a dvakrát s 200 ml n-hexanu. Je-li to nutné, může se extrakce provést v několika malých dělicích nálevkách. Když se objeví zakalené přechodné vrstvy, přidají se ke spodní fázi v prvních dvou extrakcích a k vrchní fázi poslední extrakce. Jestliže střední objem roztoku není dostačující pro rozpouštění a extrakci v případě velmi vysokého obsahu mýdla, může se použít odpovídajcí násobek.
n-hexanové frakce se spojí a promyjí se 200 ml směsi methanol-voda (80:20). Zakalené přechodné vrstvy se zachytí v n-hexanové fázi, která se odstraní.
Metanol-vodná fáze se spojí a titruje se na pH 9 1M roztokem hydroxidu sodného na fenolftalein. Roztok se zahušťuje na vodní lázni tak dlouho, až se metanol odpaří a extrakt se na vodní lázni znovu rozpustí ve vodě. Obsah MBAS tohoto roztoku se stanoví pomocí výše popsané metody.

1. 3 PŘÍPRAVA VZORKŮ

1. 3. 1 Základní výrobek, obsahující pouze MBAS, může být zkoušen v původním stavu. Pro přípavu zkušebního roztoku (M) musí být stanoven obsah MBAS

1. 3. 2 Kombinované výrobky se analyzují na obsah MBAS a mýdla. Musí se extrahovat alkoholem v souladu s následujícími podmínkami:

1. 3. 2. 1 Isopropanolová extrakce, jestliže vzorek obsahuje méně mýdla než MBAS (viz kapitola 2).

1. 3. 2. 2 Isopropanolová extrakce a odstranění mýdla, jestliže vzorek obsahuje více mýdla než MBAS (viz kapitola 2).
Pro přípravu zkušebních roztoků (M) musí být znám obsah MBAS v obou extraktech.

1. 4 ČINNOST ZAŘÍZENÍ
Provzdušňovací nádoba C a usazovací nádoba D se na počátku naplní syntetickou odpadní vodou. Výšku nádoby D je třeba nastavit tak, aby objem, obsažený v provzdušňovací nádobě C, byl 3 litry. Poté se uvede do provozu provzdušňovací zařízení G, mamutka E a dávkovací zařízení B. Syntetická odpadní voda musí protékat provzdušňovací nádobou C rychlostí jednoho litru za hodinu; z toho vyplývá střední doba zdržení 3 hodiny. Rychlost provzdušňování je nutné regulovat tak, aby obsah nádoby C byl neustále udržován v suspenzi a obsah rozpuštěného kyslíku činil nejméně 2 mg.l^-1. Pěnění je nutné předcházet vhodnými prostředky. Nesmějí se používat činidla proti pěnění, která inhibují aktivovaný kal nebo obsahují MBAS. Mamutku E je třeba nastavit tak, aby se aktivovaný kal z usazovací nádoby kontinuálně a pravidelně recykloval do provzdušňovací nádoby C. Kal, který se nashromáždí kolem horní části provzdušňovací nádoby C, na dně usazovací nádoby D nebo v cirkulačním okruhu, je nutné vracet do cirkulace nejméně jednou denně seškrabáním kartáčem nebo jiným vhodným způsobem. Pokud se kal neusazuje, je možné zvýšit jeho hustotu přídavky 2 ml dávek 5 % roztoku chloridu železitého, opakovaných podle potřeby.
Voda odtékající z usazovací nádoby D se shromažďuje v nádobě F po dobu 24 hodin, po této době se po důkladném promísení odebere vzorek.
Nádobu F je pak nutno pečlivě vyčistit.

1. 5 KONTROLA MĚŘÍCÍHO ZAŘÍZENÍ
Obsah MBAS (v mg.l^-1) v syntetické odpadní vodě se stanovuje bezprostředně před použitím.
Obsah MBAS (v mg.l^-1) v odtokové vodě, shromažďované po dobu 24 hodin v nádobě F, je třeba stanovovat analyticky stejnou metodou co nejdříve po shromáždění. Koncentrace musí být stanovena s přesností na 0,1 mg.l^-1 MBAS.
Pro kontrolu účinnosti probíhajícího procesu se nejméně dvakrát týdně ve filtrované syntetické odpadní vodě, stejně tak jako v odtokové vodě, shromažďované v nádobě F, změří chemická spotřeba kyslíku (CHSK). Úbytek CHSK se vyjadřuje v procentech.
Úbytek CHSK je ustálen, když se dosáhne přibližně pravidelného denního rozkladu MBAS, tzn. na konci záběhové doby, jak znázorňuje obrázek 3.
Ztráta žíháním sušiny aktivovaného kalu v provzdušňovací nádobě by měla být stanovena dvakrát týdně (v g.l^-1). Je-li hodnota vyšší než 2,5 mg.l^-1, nadbytečný aktivovaný kal musí být odstraněn.
Zkouška se provádí při pokojové teplotě; tato musí být stálá a nesmí klesnout pod 18 °C ani přesáhnout 30 °C.

1. 6 VÝPOČET BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI
Každý den se počítají procenta rozkladu MBAS na základě stanoveného obsahu MBAS v mg.l^-1 v syntetické odpadní vodě a odpovídající odtokové vodě, shromažďované v nádobě F.
Takto získané hodnoty rozkladu se znázorňují graficky jak je ukázáno na obrázku 3 (poznámka 1. 7. 2).
Rozložitelnost MBAS se vypočte jako aritmetický průměr hodnot, získaných během 21 dní, které následují po záběhové době, během nichž byl rozklad pravidelný a provoz zařízení bezporuchový. V žádném případě nemá trvání záběhové doby přesáhnout šest týdnů.

1. 7 POZNÁMKY

1. 7. 1 Při stanovení biologické rozložitelnosti zohledňují některé předpisy obsah mýdla.

1. 7. 2 V některých případech je možné připustit nižší frekvenci odběru vzorků, např. 1 vzorek za každé dva až tři dny, avšak pro výpočet průměrné hodnoty je třeba použít nejméně 14 výsledků, získaných během 21 dní následujících po záběhové době.