IX.1.6 Popis zkušební metody

IX.1.6.1 Příprava standardních roztoků polystyrénu
Polystyrenové standardy se rozpustí opatrným smícháním se zvoleným elučním činidlem. Při přípravě roztoků se musí zohlednit doporučení výrobce.
Koncentrace zvolených standardů závisí na různých faktorech, např. na vstřikovaném objemu, viskozitě roztoku a citlivosti analytického detektoru. Maximální vstřikovaný objem musí být přizpůsoben délce kolony, aby nedošlo k přesycení. Typické vstřikované objemy pro analytickou separaci pomocí GPC s kolonou o rozměrech 30x7,8 mm jsou obvykle 40 až 100 μl. Větší objemy jsou možné, ale neměly by překročit 250 μl. Optimální poměr mezi vstřikovaným objemem a koncentrací musí být stanoven před vlastní kalibrací kolony.

IX.1.6.2 Příprava roztoku vzorku
Stejné požadavky platí v zásadě pro přípravu roztoků vzorku. Vzorek se opatrným protřepáním rozpustí ve vhodném rozpouštědle, např. v tetrahydrofuranu (THF). V žádném případě by neměl být rozpuštěn pomocí ultrazvukové lázně. Je-li to nezbytné, přečistí se roztok vzorku filtrací přes membránový filtr o velikosti pórů 0,2 až 2 μm.
Přítomnost nerozpuštěných částic musí být zaznamenána v konečném protokolu, neboť mohou pocházet z frakcí s vysokou molekulovou hmotností. Pro stanovení hmotnostního podílu nerozpuštěných částic vyjádřeného v procentech by měla být použita vhodná metoda. Roztoky by měly být použity do 24 hodin.

IX.1.6.3 Přístroje a pomůcky
— zásobník rozpouštědla,
— odplynovací zařízení (podle potřeby),
— čerpadlo,
— tlumič rázů (podle potřeby),
— vstřikovací systém,
— chromatografické kolony,
— detektor,
— průtokoměr (podle potřeby),
— zapisovač,
— nádoba na odpad.
Musí být zajištěno, aby byl GPC systém inertní k použitým rozpouštědlům (např. použitím ocelových kapilár pro THF).

IX.1.6.4 Vstřikování a systém dávkování rozpouštědla
Definovaný objem roztoku vzorku se nanáší na kolonu buď ručně, nebo dávkovačem do ostře ohraničené zóny. Příliš rychlý pohyb pístu vzad nebo vpřed (při ručním nanášení) může způsobit změny v pozorovaném rozdělení molekulové hmotnosti. Dávkovač rozpouštědla by pokud možno neměl působit rázy a v ideálním případě by měl být osazen tlumičem rázů. Průtok je řádově 1 ml/min.

IX.1.6.5 Kolona
Podle typu vzorku se polymer charakterizuje použitím jednoduché kolony nebo několika za sebou řazenými kolonami. Komerčně je dostupná řada porézních materiálů definovaných vlastností (např. velikost pórů, meze zadržení).Výběr separačního gelu nebo délky kolony závisí jak na vlastnostech vzorku (hydrodynamický objem, distribuce molekulové hmotnosti), tak na specifických podmínkách separace, jako jsou rozpouštědlo, teplota a průtok (1), (2), (3).

IX.1.6.6 Teoretická patra
Použitá kolona nebo kombinace kolon musí být charakterizována počtem teoretických pater. V případě použití THF jako elučního činidla to znamená nanesení roztoku ethylbenzenu nebo jiného vhodného nepolárního roztoku na kolonu známé délky. Počet teoretických pater je dán následující rovnicí
$N=\mathrm{5,54}{\frac{V_e}{W_{\frac{1}{2}}}}^2\text{nebo N}=16{\frac{V_e}{W}}^2$
kde
N je počet teoretických pater,
V_e je eluční objem v maximu píku,
W šířka základny píku,
W_½ šířka píku v polovině výšky.

IX.1.6.7 Separační účinnost
Vedle počtu teoretických pater, který je veličinou určující šířku pásu, hraje roli také separační účinnost, která se stanoví ze strmosti kalibrační křivky. Separační účinnost kolony se získá z následujícího vztahu:
$\frac{V_{e,M_x-}{V}_{e,10M_x}}{\text{plocha průřezu kolony}}\ge \mathrm{6,0}\frac{{cm}^3}{{cm}^2}$
kde
V_e,Mx je eluční objem pro polystyren s molekulovou hmotností M_x,
V_e(10Mx) je eluční objem pro polystyren s 10krát větší molekulovou hmotností.
Rozlišení systému je obecně definováno tímto vztahem:
$R_{\mathrm{1,2}}=2\times \frac{V_{el}-V_{e2}}{W_1+W_2}\times \frac{1}{{log}_{10}{M}_2/M_1}$
kde
V_e1,V_e2 jsou eluční objemy dvou standardů polystyrénu v maximu píku,
W₁, W₂ jsou šířky základen píků,
M₁, M₂ molekulové hmotnosti odpovídající maximu píků (měly by se lišit faktorem 10).
Hodnota R pro kolonový systém by měla být větší než 1,7 (4).

IX.1.6.8 Rozpouštědla
Všechna rozpouštědla musí mít vysokou čistotu (v případě THF 95% čistoty). Zásobník rozpouštědla (v případě potřeby pod inertní atmosférou) musí být dostatečně velký pro kalibraci kolony a pro několik analýz vzorku. Z rozpouštědla musí být před jeho nanesením čerpadlem na kolonu odstraněny plyny.

IX.1.6.9 Kontrola teploty
Teplota kritických vnitřních součástí (vstřikovací smyčky, kolon, detektoru a potrubí) by měla být konstantní a měla by být sladěna s volbou rozpouštědla.

IX.1.6.10 Detektor
Detektor slouží ke kvantitativnímu zaznamenávání koncentrace vzorku eluovaného z kolony. Nemá-li dojít ke zbytečnému rozšíření píků, musí být objem kyvety detekční cely co nejmenší. Neměl by být větší než 10 μl, s výjimkou detektorů k měření rozptylu světla a viskozity. K detekci se obvykle používají diferenciální refraktometry. Vyžadují-li si to však specifické vlastnosti vzorku nebo elučního rozpouštědla, lze použít jiné typy detektorů, např. UV/VIS, IR detektory a detektory viskozity atd.