IX. METODA PRO STANOVENÍ ČÍSELNĚ STŘEDNÍ MOLEKULOVÉ HMOTNOSTI A DISTRIBUCE MOLEKULOVÉ HMOTNOSTI POLYMERŮ – metoda A.18 podle přílohy směrnice Komise 98/73/ES ze dne 18. září 1998, kterou se po čtyřiadvacáté přizpůsobuje technickému pokroku směrnici Rady 67/548/EHS o sbližování právních a správních předpisů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek (dále jen „směrnice 98/73/ES“)
PŘÍLOHA
Příklady jiných metod stanovení číselně střední molekulové hmotnosti (M_n) polymerů
Gelová permeační chromatografie (GPC) je přednostní metodou stanovení M_n, zejména tehdy, je-li k dispozici sada standardů, jejichž struktura je srovnatelná se strukturou polymeru. Vyskytnou-li se praktické obtíže při použití GPC nebo očekává-li se, že látka nevyhoví regulačním kritériím na M_n (což je třeba potvrdit), jsou k dispozici alternativní metody, jako jsou:
LITERATURA

(1) Billmeyer, F.W. Jr., (1984). Textbook of Polymer Science, 3rd Edn, John Wiley, New York.

(2) Glover C.A., (1975). Absolute Colligative Property Methods. Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I, P.E Slade, Jr. ed., Marcel Dekker, New York.

(3) ASTM D 3750-79, (1979). Standard Practice for Determination of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Membrane Osmometry. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

(4) Coll, H. (1989). Membrane Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A.R.Cooper ed., J. Wiley and Sons, pp. 25 to 52.

(5) ASTM 3592-77, (1977). Standard Recomended Practice for Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

(6) Morris, C.E.M., (1989). Vapour Pressure Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A.R.Cooper ed., J. Wiley and Sons.

(7) Schröder, E., Müller, G., Arndt, K-F., (1989). Polymer Characterisation, Carl Hanser Verlag, Munich.

(8) Garmon, R.G., (1975). End-Group Determinations, Chapter 3. In: Polymer Molecular Weights, Part I, P.E. Slade, Jr. ed. Marcel Dekker, New York.

(9) Amiya, S., et al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, 2139-2146.

IX.1. METODA
Tato metoda gelové permeační chromatografie je replikou metody OECD TG 118 (1996). Základní principy a další technické informace jsou uvedeny v odkaze 1.

IX.1.1 Úvod
Vlastnosti polymerů jsou tak rozdílné, že je nemožné popsat jedinou metodu a stanovit přesně podmínky separace a hodnocení, které by pokryly všechny eventuality a specifika vyskytující se při separaci polymerů. Zejména pro komplexní polymerní systémy není gelová permeační chromatografie (GPC) vždy vhodná. Není-li GPC použitelná, může být molekulová hmotnost stanovena jinými metodami (viz příloha). V takových případech by měly být uvedeny veškeré podrobnosti a zdůvodnění použité metody.
Popsaná metoda je založena na normě DIN 55672 (1). Podrobné informace o provádění experimentů a o hodnocení dat lze nalézt v uvedené normě DIN. V případě, že jsou nezbytné úpravy experimentálních podmínek, musí být změny zdůvodněny. Mohou být použity jiné normy, jsou-li uvedeny kompletní odkazy na ně. V popsané metodě jsou ke kalibraci použity vzorky polystyrenu o známé polydisperzitě a metoda může být upravena tak, aby byla vhodná pro určité polymery, např. vodorozpustné větvené polymery s dlouhým řetězcem.

1. Použití koligativních vlastností

1.1 Ebulioskopie/kryoskopie: spočívá v měření zvýšení bodu varu (ebulioskopie) nebo snížení bodu tuhnutí (kryoskopie) rozpouštědla po přidání polymeru. Metoda je založena na skutečnosti, že vliv rozpuštěného polymeru na bod varu/bod tuhnutí závisí na molekulové hmotnosti polymeru (1), (2).
Použitelnost: M_n < 20 000.

1.2 Snížení tlaku par: spočívá v měření tlaku par zvolené referenční kapaliny před přidáním a po přidání známého množství polymeru (1), (2).
Použitelnost: M_n < 20 000 (teoretická; v praxi však má omezený význam).

1.3 Membránová osmometrie: spočívá na principu osmózy, tj. přirozené snahy molekul rozpouštědla proniknout polopropustnou membránou ze zředěného do koncentrovaného roztoku a ustavit rovnováhu. Při zkoušce je koncentrace zředěného roztoku nulová, zatímco koncentrovaný roztok obsahuje polymer. Pronikáním rozpouštědla membránou dochází ke tlakovému rozdílu, který závisí na koncentraci a molekulové hmotnosti polymeru (1), (3), (4).
Použitelnost: M_n od 20 000 do 200 000.

1.4 Osmometrie - tlak páry: spočívá ve srovnání rychlosti vypařování čistého rozpouštědla s alespoň třemi aerosoly obsahujícími polymer v různých koncentracích (1), (5), (6).
Použitelnost: M_n < 20 000.

IX.1.2 Definice a jednotky
Číselně střední molekulová hmotnost M_n a hmotnostně střední molekulová hmotnost M_w se stanoví pomocí následujících rovnic:

$M_n=\frac{\sum _{i=1}^n{H}_i}{{\sum }_{i=1}^n\frac{H_i}{M_i}}$

$M_w=\frac{\sum _{i=1}^n{H}_i\times M_i}{\sum _{i=1}^n{H}_i}$

kde
H_i je výška signálu detektoru nad základnou pro retenční objem V_i,
M_i je molekulová hmotnost frakce polymeru pro retenční objem V_i, a n je počet dat.
Šířka distribuce molekulové hmotnosti, která je mírou disperzity systému, je dána poměrem M_w/M_n.

IX.2 DATA A ZPRÁVY

IX.2.1 Data
Pokud jde o podrobná kritéria hodnocení a o požadavky týkající se registrace a zpracování dat, měla by být použita norma DIN (1).
Pro každý vzorek musí být provedeny dva nezávislé experimenty. Analýzy musí být provedeny samostatně.
Pro každé měření musí být uvedeny hodnoty M_n, M_w, M_w/M_n a M_p. Je nezbytné výslovně uvést, že naměřené hodnoty jsou relativními hodnotami odpovídajícími molekulové hmotnosti použitého standardu.
Po stanovení retenčních objemů nebo retenčních časů (případně korigovaných za použití vnitřního standardu) se proti těmto veličinám vynesou do grafu hodnoty log M_p (přičemž M_p je výška maxima píku kalibračního standardu). Na jednu dekádu hodnot molekulární hmotnosti jsou nezbytné alespoň dva kalibrační body a pro celou křivku, která by měla pokrýt odhadovanou molekulovou hmotnost vzorku, se požaduje alespoň pět naměřených bodů. Poslední bod kalibrační křivky na straně nízkých molekulových hmotností se definuje n-hexylbenzenem nebo jiným vhodným nepolárním rozpouštědlem. Číselně střední a hmotnostně střední molekulová hmotnost se obecně stanoví elektronickým zpracováním dat založeným na vzorcích v bodě 1.2. V případě manuálního hodnocení lze použít metodu ASTM D 3536-91 (3).
Distribuční křivka musí být vyvedena ve formě tabulky nebo graficky (diferenciální četnost nebo kumulativní četnost v procentech proti log M). V případě grafické prezentace by měla mít jedna dekáda molekulární hmotnosti délku 4 cm a výška maxima píku by měla být asi 8 cm. V případě integrálních distribučních křivek by měla být vzdálenost mezi 0 a 100 % na ordinátě přibližně 10 cm.

IX.2.2 Protokol o zkoušce
Protokol o zkoušce musí obsahovat následující informace:

IX.2.2.1 Zkušební látka
— dostupné informace o zkušební látce (identita, přísady, nečistoty),
— popis zpracování vzorku, pozorované skutečnosti, problémy.

IX.2.2.2 Vybavení
— zásobník elučního činidla, inertní plyn, odstranění plynu z elučního činidla, složení elučního činidla, nečistoty,
— čerpadlo, tlumič rázů, vstřikovací systém,
— separační kolony (výrobce, všechny informace o charakteristikách kolon, jako jsou velikost pórů, druh separačního materiálu atd., počet, délka a pořadí použitých kolon),
— počet teoretických pater kolony (nebo kombinace kolon), separační účinnost (rozlišení systému),
— informace o symetrii píků,
— teplota kolony, způsob kontroly teploty,
— detektor (princip měření, typ, objem kyvety),
— průtokoměr, je-li použit (výrobce, princip měření),
— systém pro zaznamenávání a zpracování dat (hardware a software).

IX.2.2.3 Kalibrace systému
— podrobný popis metody použité pro sestrojení kalibrační křivky,
— informace o kritériích kvality této metody (např. korelační koeficient, chyba součtu čtverců atd.),
— informace o všech extrapolacích, předpokladech a aproximacích provedených během experimentálního postupu a při hodnocení a zpracování dat,
— všechny naměřené hodnoty použité při konstrukci kalibrační křivky musí být dokumentovány v tabulce, která musí pro každý kalibrační bod obsahovat následující informace:
— název vzorku,
— výrobce vzorku,
— charakteristické hodnoty standardů M_p, M_n, M_w a M_w/M_n, jak jsou poskytnuty výrobcem nebo jak jsou zjištěny z následných měření, společně s podrobnostmi o metodě stanovení,
— vstříknutý objem a vstříknutá koncentrace,
— hodnota M_p použitá po kalibraci,
— eluční objem nebo korigovaný retenční čas měřený v maximu píku,
— hodnota M_p vypočtená pro maximum píku,
— chyba vypočtené hodnoty M_p a kalibrační hodnoty M_p vyjádřená v procentech.

IX.2.2.4 Hodnocení
— hodnocení na základě časové závislosti: metody použité pro zajištění požadované reprodukovatelnosti (metoda korekce, vnitřní standard atd.),
— informace o tom, zda hodnocení bylo provedeno na základě elučního objemu nebo retenčního času,
— informace o omezeních hodnocení v případě, že pík nebyl kompletně analyzován,
— popis metody hlazení, bylo-li použito,
— příprava a postupy předběžné úpravy vzorku,
— popřípadě přítomnost nerozpuštěných částic,
— vstříknutý objem (μl) a vstříknutá koncentrace (mg/ml),
— pozorované skutečnosti, které vedou k odchylkám od ideálních charakteristik metody GPC,
— podrobný popis všech změn zkušebních postupů,
— podrobnosti o rozsahu chyb,
— jakékoliv další informace a pozorování relevantní pro interpretaci výsledků.

2. Analýza koncových skupin
Použití této metody vyžaduje znalost jak celkové struktury polymeru, tak povahy koncových skupin řetězce (které musí být odlišitelné od hlavního řetězce například metodou NMR nebo titrací/derivatizací). Stanovení počtu koncových skupin polymeru může vést k hodnotě molekulové hmotnosti (7), (8), (9).
Použitelnost: M_n až do 50 000 (s klesající spolehlivostí).

IX.1.3 Referenční látky
Vzhledem k tomu, že GPC je relativní metoda, musí být provedena kalibrace. K tomuto účelu se obvykle používá lineární polystyrenový standard s úzkou distribucí se známými středními molekulovými hmotnostmi M_n a M_w a se známým rozdělením molekulové hmotnosti. Kalibrační křivka může být pro stanovení molekulové hmotnosti neznámého vzorku použita pouze tehdy, byly-li podmínky separace vzorku a standardů identické. Pevný vztah mezi molekulovou hmotností a elučním objemem je platný pouze za specifických podmínek určitého experimentu. Podmínky zahrnují především teplotu, rozpouštědlo (nebo směs rozpouštědel), chromatografické podmínky a separační kolonu nebo systém separačních kolon.
Molekulové hmotnosti stanovené tímto způsobem jsou relativními hodnotami a označují se jako „molekulární hmotnosti polystyrenového ekvivalentu“. To znamená, že se molekulová hmotnost bude v závislosti na strukturních a chemických rozdílech mezi vzorkem a standardem od absolutní hodnoty více či méně lišit. Použijí-li se jiné standardy, např. polyethylenglykol, polyethylenoxid, polymethylmethakrylát, polyakrylová kyselina, musí být použití zdůvodněno.

IX.3 LITERATURA

(1) DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.

(2) Yau, W. W., Kirkland, J. J., Bly, D. D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.

(3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

(4) ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

IX.1.4 Princip zkušební metody
Rozdělení molekulové hmotnosti vzorku i střední molekulové hmotnosti (M_n, M_w) lze stanovit metodou GPC. GPC je speciální typ kapalinové chromatografie, při němž je vzorek rozdělen podle hydrodynamických objemů jeho jednotlivých složek (2).
Separace probíhá při průchodu vzorku kolonou naplněnou porézním materiálem, obvykle organickým gelem. Malé molekuly proniknou póry, zatímco velké molekuly jsou zadrženy. Průchod velkých molekul je tedy kratší a jsou eluovány nejdříve. Středně velké molekuly pronikají některými póry a jsou eluovány později. Nejmenší molekuly se středním hydrodynamickým poloměrem menším než velikost pórů gelu pronikají všemi póry. Tyto molekuly jsou eluovány nakonec.
V ideálním případě závisí separace pouze na velkosti molekul, ale v praxi je obtížné vyhnout se alespoň některým rušivým absorpčním jevům. Nestejnoměrná náplň kolony a mrtvé objemy mohou situaci zhoršit (2).
Detekce se provádí například prostřednictvím měření indexu lomu nebo absorpce UV a dává jednoduchou distribuční křivku. Má-li být však křivce přiřazena skutečná molekulová hmotnost, je nezbytné kalibrovat kolonu průchodem polymerů o známé molekulové hmotnosti a v ideálním případě s v podstatě podobnou strukturou, např. různé polystyrenové standardy. Křivka má zpravidla gaussovský tvar, někdy deformovaný prodloužením na straně nízké molekulové hmotnosti, přičemž svislá osa udává hmotnostní podíl různých molekulových hmotnostní a na vodorovné ose jsou vynesen logaritmus molekulové hmotnosti.

IX.1.5 Kritéria kvality
Opakovatelnost (relativní směrodatná odchylka: RSD) elučního objemu by měla být lepší než 0,3 %. Požadovaná opakovatelnost musí být zajištěna korekcí prostřednictvím standardů, je-li chromatogram hodnocen jako funkce času a neodpovídá výše uvedenému kritériu (1).
Polydisperzity jsou závislé na molekulových hmotnostech standardů. V případě polystyrenových standardů jsou typickými hodnotami

Mp < 2 000	Mw/Mn < 1,20
2000 = MP =106	Mw/Mn < 1,05
Mp > 106	Mw/Mn < 1,20

(M_p je molekulová hmotnost standardu v maximu píku)

IX.1.6 Popis zkušební metody

IX.1.6.1 Příprava standardních roztoků polystyrénu
Polystyrenové standardy se rozpustí opatrným smícháním se zvoleným elučním činidlem. Při přípravě roztoků se musí zohlednit doporučení výrobce.
Koncentrace zvolených standardů závisí na různých faktorech, např. na vstřikovaném objemu, viskozitě roztoku a citlivosti analytického detektoru. Maximální vstřikovaný objem musí být přizpůsoben délce kolony, aby nedošlo k přesycení. Typické vstřikované objemy pro analytickou separaci pomocí GPC s kolonou o rozměrech 30x7,8 mm jsou obvykle 40 až 100 μl. Větší objemy jsou možné, ale neměly by překročit 250 μl. Optimální poměr mezi vstřikovaným objemem a koncentrací musí být stanoven před vlastní kalibrací kolony.

IX.1.6.2 Příprava roztoku vzorku
Stejné požadavky platí v zásadě pro přípravu roztoků vzorku. Vzorek se opatrným protřepáním rozpustí ve vhodném rozpouštědle, např. v tetrahydrofuranu (THF). V žádném případě by neměl být rozpuštěn pomocí ultrazvukové lázně. Je-li to nezbytné, přečistí se roztok vzorku filtrací přes membránový filtr o velikosti pórů 0,2 až 2 μm.
Přítomnost nerozpuštěných částic musí být zaznamenána v konečném protokolu, neboť mohou pocházet z frakcí s vysokou molekulovou hmotností. Pro stanovení hmotnostního podílu nerozpuštěných částic vyjádřeného v procentech by měla být použita vhodná metoda. Roztoky by měly být použity do 24 hodin.

IX.1.6.3 Přístroje a pomůcky
— zásobník rozpouštědla,
— odplynovací zařízení (podle potřeby),
— čerpadlo,
— tlumič rázů (podle potřeby),
— vstřikovací systém,
— chromatografické kolony,
— detektor,
— průtokoměr (podle potřeby),
— zapisovač,
— nádoba na odpad.
Musí být zajištěno, aby byl GPC systém inertní k použitým rozpouštědlům (např. použitím ocelových kapilár pro THF).

IX.1.6.4 Vstřikování a systém dávkování rozpouštědla
Definovaný objem roztoku vzorku se nanáší na kolonu buď ručně, nebo dávkovačem do ostře ohraničené zóny. Příliš rychlý pohyb pístu vzad nebo vpřed (při ručním nanášení) může způsobit změny v pozorovaném rozdělení molekulové hmotnosti. Dávkovač rozpouštědla by pokud možno neměl působit rázy a v ideálním případě by měl být osazen tlumičem rázů. Průtok je řádově 1 ml/min.

IX.1.6.5 Kolona
Podle typu vzorku se polymer charakterizuje použitím jednoduché kolony nebo několika za sebou řazenými kolonami. Komerčně je dostupná řada porézních materiálů definovaných vlastností (např. velikost pórů, meze zadržení).Výběr separačního gelu nebo délky kolony závisí jak na vlastnostech vzorku (hydrodynamický objem, distribuce molekulové hmotnosti), tak na specifických podmínkách separace, jako jsou rozpouštědlo, teplota a průtok (1), (2), (3).

IX.1.6.6 Teoretická patra
Použitá kolona nebo kombinace kolon musí být charakterizována počtem teoretických pater. V případě použití THF jako elučního činidla to znamená nanesení roztoku ethylbenzenu nebo jiného vhodného nepolárního roztoku na kolonu známé délky. Počet teoretických pater je dán následující rovnicí
$N=\mathrm{5,54}{\frac{V_e}{W_{\frac{1}{2}}}}^2\text{nebo N}=16{\frac{V_e}{W}}^2$
kde
N je počet teoretických pater,
V_e je eluční objem v maximu píku,
W šířka základny píku,
W_½ šířka píku v polovině výšky.

IX.1.6.7 Separační účinnost
Vedle počtu teoretických pater, který je veličinou určující šířku pásu, hraje roli také separační účinnost, která se stanoví ze strmosti kalibrační křivky. Separační účinnost kolony se získá z následujícího vztahu:
$\frac{V_{e,M_x-}{V}_{e,10M_x}}{\text{plocha průřezu kolony}}\ge \mathrm{6,0}\frac{{cm}^3}{{cm}^2}$
kde
V_e,Mx je eluční objem pro polystyren s molekulovou hmotností M_x,
V_e(10Mx) je eluční objem pro polystyren s 10krát větší molekulovou hmotností.
Rozlišení systému je obecně definováno tímto vztahem:
$R_{\mathrm{1,2}}=2\times \frac{V_{el}-V_{e2}}{W_1+W_2}\times \frac{1}{{log}_{10}{M}_2/M_1}$
kde
V_e1,V_e2 jsou eluční objemy dvou standardů polystyrénu v maximu píku,
W₁, W₂ jsou šířky základen píků,
M₁, M₂ molekulové hmotnosti odpovídající maximu píků (měly by se lišit faktorem 10).
Hodnota R pro kolonový systém by měla být větší než 1,7 (4).

IX.1.6.8 Rozpouštědla
Všechna rozpouštědla musí mít vysokou čistotu (v případě THF 95% čistoty). Zásobník rozpouštědla (v případě potřeby pod inertní atmosférou) musí být dostatečně velký pro kalibraci kolony a pro několik analýz vzorku. Z rozpouštědla musí být před jeho nanesením čerpadlem na kolonu odstraněny plyny.

IX.1.6.9 Kontrola teploty
Teplota kritických vnitřních součástí (vstřikovací smyčky, kolon, detektoru a potrubí) by měla být konstantní a měla by být sladěna s volbou rozpouštědla.

IX.1.6.10 Detektor
Detektor slouží ke kvantitativnímu zaznamenávání koncentrace vzorku eluovaného z kolony. Nemá-li dojít ke zbytečnému rozšíření píků, musí být objem kyvety detekční cely co nejmenší. Neměl by být větší než 10 μl, s výjimkou detektorů k měření rozptylu světla a viskozity. K detekci se obvykle používají diferenciální refraktometry. Vyžadují-li si to však specifické vlastnosti vzorku nebo elučního rozpouštědla, lze použít jiné typy detektorů, např. UV/VIS, IR detektory a detektory viskozity atd.