XXIV. METODA PRO STANOVENÍ AEROBNÍ A ANAEROBNÍ TRANSFORMACE V SYSTÉMECH VODA-SEDIMENT
(metoda C.24 podle přílohy směrnice 2004/73/ES ze dne 29. dubna 2004, kterou se po dvacáté deváté přizpůsobuje technickému pokroku směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování právních a správních předpisů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek)
DODATEK 1
POKYNY K AEROBNÍM A ANAEROBNÍM ZKUŠEBNÍM SYSTÉMŮM
Aerobní zkušební systém
Aerobní zkušební systém popsaný v této zkušební metodě se skládá z aerobní vodní vrstvy (typická koncentrace kyslíku v rozmezí od 7 do 10 mg∙l-1) a vrstvy sedimentu, která je na povrchu aerobní a pod povrchem anaerobní (typické průměrné oxidačně-redukční potenciály (Eh) v anaerobní zóně sedimentu jsou v rozmezí -80 až -190 mV). Nad vodní hladinu v každé inkubační jednotce se zavádí zvlhčený vzduch, aby se v prostoru pod víčkem udržovala dostatečná koncentrace kyslíku.
Anaerobní zkušební systém
Pro anaerobní zkušební systém je zkušební postup v podstatě tentýž, jako postup popsaný pro aerobní systém, liší se však tím, že nad hladinu vody v každé inkubační jednotce se zavádí zvlhčený dusík, aby se udržovala jeho koncentrace v prostoru pod víčkem. Sediment a voda jsou považovány za anaerobní, pokud je oxidačně-redukční potenciál (Eh) nižší -100 mV.
V anaerobní zkoušce se mineralizace posuzuje na základě měření uvolněného oxidu uhličitého a methanu.
DODATEK 2
PŘÍKLAD SKLENĚNÉ PRŮTOKOVÉ APARATURY

DODATEK 3
PŘÍKLAD BIOMETRICKÉ APARATURY

DODATEK 4
PŘÍKLAD VÝPOČTU DÁVKY APLIKOVANÉ DO ZKUŠEBNÍCH NÁDOB

Vnitřní průměr válce:= 8 cm
Výška vodního sloupce bez sedimentu:= 12 cm
Plocha hladiny: 3,142 × 42= 50,3 cm2
Dávkování: 500 g zkoušené látky na ha odpovídá 5 μg/cm2
Celkové množství v μg: 5 × 50,3= 251,5 μg
Přepočet celkového množství na hloubku 100 cm:
12 × 251,5 ÷ 100= 30,18 μg
Objem vodního sloupce: 50,3 × 12= 603 ml
Koncentrace ve vodě: 30,18 ÷ 603= 0,050 μg/ml nebo 50 μg/l

XXIV.1. METODA
Tato zkušební metoda je replikou metody OECD TG 308 (2002).

XXIV.1.1 ÚVOD
Chemické látky se mohou dostat do mělkých nebo hlubokých povrchových vod takovými cestami, jako jsou přímá aplikace, unášení postřiku, odtok, ukládání odpadu, průmyslové, komunální nebo zemědělské emise a atmosférický spad. V této zkušební metodě je popsán laboratorní postup posouzení aerobní a anaerobní transformace organických chemických látek v systémech voda-sediment. Je založena na doporučeních a směrnicích národních a mezinárodních organizací (viz literatura 1 až 8). Tyto studie jsou požadovány u látek, které jsou aplikovány bezprostředně do vody nebo které se mohou dostat do vody výše uvedenými cestami.
Podmínky ve vrchní vodní fázi přírodních systémů voda-sediment jsou často aerobní. Podmínky v povrchové vrstvě sedimentu mohou být buď aerobní, nebo anaerobní, zatímco podmínky hlouběji v sedimentu jsou obvykle anaerobní. S cílem zahrnout všechny tyto možnosti je v tomto dokumentu popsána zkouška jak za aerobních podmínek, tak za anaerobních podmínek. Aerobní zkouškou se simuluje aerobní vodní sloupec nad aerobní vrstvou sedimentu, pod níž leží vrstva s anaerobním gradientem. Anaerobní zkouška simuluje zcela anaerobní systém voda-sediment. Pokud je z okolností zřejmé, že je třeba se odchýlit od těchto doporučení, např. použít nedotčené střední vrstvy sedimentů nebo sedimenty, které mohly být exponovány zkoušenou látkou, existují jiné metody určené k tomuto účelu (viz literatura 9).

XXIV.1.2 DEFINICE
Ve všech případech je třeba používat jednotky mezinárodní soustavy jednotek (SI).
Zkoušená látka: jakákoli látka, ať již výchozí látka, nebo příslušné transformační produkty.
Transformační produkty: všechny látky vznikající při biotických a abiotických transformačních reakcích zkoušené látky, včetně CO2 a vázaných reziduí.
Vázaná rezidua: „Vázaná rezidua“ jsou sloučeniny v půdě, rostlině nebo v živočichu, které po extrakci zůstávají v matrici ve formě výchozí látky nebo jejího metabolitu (jejích metabolitů). Metoda extrakce nesmí podstatně měnit samotné sloučeniny nebo strukturu matrice. Povahu vazeb lze částečně vyjasnit extrakcí spojenou se změnami v matrici a náročnými analytickými technikami. Dosud byly tímto způsobem vyjasněny např. kovalentní, iontové a adsorpční vazby a rovněž záchyty. Tvorba vázaných reziduí obecně podstatně snižuje biologickou přístupnost a dostupnost (viz literatura 10) [upraveno IUPAC 1984 (viz literatura 11)].
Aerobní transformace: (oxidační): reakce, ke kterým dochází za přítomnosti kyslíku (viz literatura 12).
Anaerobní transformace: (redukční): reakce probíhající s vyloučením molekulárního kyslíku (viz literatura 12).
Sediment: je směs minerálních a organických chemických složek, přičemž organické složky obsahují sloučeniny s vysokým obsahem uhlíku a dusíku a vysokou molekulovou hmotností. Ukládají se v povrchových vodách a vytvářejí rozhraní s těmito vodami.
Mineralizace: je úplný rozklad organické sloučeniny na CO2 a H2O za aerobních podmínek a na CH4, CO2 a H2O za anaerobních podmínek. V rámci této zkušební metody, při níž se používají sloučeniny značené radioisotopy, se mineralizací rozumí rozsáhlý rozklad molekuly, při němž se značící atomy uhlíku kvantitativně oxidují nebo redukují, přičemž se uvolňuje odpovídající množství 14CO2 nebo 14CH4.
Poločas, t0,5, je čas, za který dojde k 50% transformaci zkoušené látky, jestliže lze transformaci popsat kinetikou prvního řádu; nezávisí na počáteční koncentraci.
DT50 (doba odbourání 50): doba, za kterou se počáteční koncentrace zkoušené látky sníží o 50 %.
DT75 (doba odbourání 75): doba, za kterou se počáteční koncentrace zkoušené látky sníží o 75 %.
DT90 (doba odbourání 90): doba, za kterou se počáteční koncentrace zkoušené látky sníží o 90 %.

XXIV.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY
Referenční látky by měly být použity pro identifikaci a kvantitativní stanovení transformačních produktů spektroskopickými a chromatografickými metodami.

XXIV.1.4 INFORMACE O ZKOUŠENÉ LÁTCE
Pro stanovení rychlosti transformace lze použít jak látky neznačené radioisotopy, tak značené látky, přičemž značené materiály jsou upřednostňovány. Značený materiál je nezbytný pro studium způsobu transformace a pro stanovení látkové bilance. Doporučuje se značení isotopem 14C, avšak užitečné mohou být i jiné isotopy, např. 13C, 15N, 3H, 32P. Značena by měla být pokud možno nejstabilnější část (části) molekuly. Pokud například látka obsahuje kruh, je třeba tento kruh označit; pokud látka obsahuje dva nebo více kruhů, může být nezbytné provést samostatné studie za účelem stanovení osudu každého z označených kruhů, a získat tak vhodné informace o tvorbě transformačních produktů. Chemická a/nebo radiochemická čistota látky by měla být alespoň 95 %.
Před provedením zkoušky by měly být k dispozici tyto informace o látce:
Poznámka: Ve zprávě se uvede teplota, při které byla měření prováděna.
Mezi další užitečné informace patří údaje o toxicitě zkoušené látky pro půdní mikroorganismy, údaje o snadné nebo vlastní biologické rozložitelnosti a údaje o aerobní a anaerobní transformaci v půdě.
K dispozici by měly být analytické metody (včetně extrakčních a izolačních metod) pro kvantitativní stanovení a identifikaci zkoušené látky a jejích transformačních produktů ve vodě a sedimentu (viz oddíl 1.7.2).

a) rozpustnost ve vodě (metoda A.6);

b) rozpustnost v organických rozpouštědlech;

c) tlak par (metoda A.4) a Henryho konstanta;

d) rozdělovací koeficient n-oktanol/voda (metoda A.8);

e) adsorpční koeficient (podle potřeby Kd, Kf nebo Koc) (metoda C.18);

f) hydrolýza (metoda C.7);

g) disociační konstanta (pKa) [směrnice OECD 112] (viz literatura 13);

h) chemická struktura zkoušené látky a případně poloha značícího nuklidu.

XXIV.1.5 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY
V metodě popsané v této zkoušce se používají aerobní i anaerobní systémy voda-sediment (viz dodatek 1), které umožňují
i) měřit rychlost transformace zkoušené látky v systému voda-sediment,
ii) měřit rychlost transformace zkoušené látky v sedimentu,
iii) měřit rychlost mineralizace zkoušené látky a/nebo produktů její transformace (pokud se použije zkoušená látka značená isotopem 14C),
iv) identifikaci a kvantitativní stanovení produktů transformace ve vodě a v sedimentu, včetně látkové bilance (pokud se použije značená zkoušená látka),
v) měřit distribuci zkoušené látky a produktů její transformace mezi dvěma fázemi během inkubace v temnu (aby nedošlo např. k vykvetení řas) při konstantní teplotě. Pokud to údaje umožňují, stanoví se poločasy a hodnoty DT50, DT75 a DT90, které by však neměly být příliš extrapolovány mimo obor experimentálních hodnot (viz oddíl 1.2).
Pro aerobní i anaerobní studie jsou nezbytné alespoň dva sedimenty a příslušné vodní fáze (viz literatura 7). V některých případech by však měly být použity více než dva systémy voda-sediment, např. u chemických látek, které mohou být přítomny ve sladkovodním i mořském ekosystému.

XXIV.1.6 POUŽITELNOST ZKOUŠKY
Tato je metoda je použitelná pro všechny chemické látky (neznačené nebo značené radioaktivními isotopy), pro něž je k dispozici analytická metoda s dostatečnou správností a citlivostí. Je použitelná pro mírně těkavé a netěkavé sloučeniny rozpustné nebo špatně rozpustné ve vodě. Zkouška by neměla být použita u látek, které z vody silně těkají (např. fumiganty, organická rozpouštědla), a nelze je tedy ve vodě nebo v sedimentu udržet za experimentálních podmínek této zkoušky.
Tato metoda je dosud používána ke studiu transformace chemických látek ve sladkovodním systému voda-sediment, avšak může být v zásadě použita také na estuarní a mořské systémy. Není vhodná k simulaci podmínek v tekoucích vodách (např. řekách) nebo na otevřeném moři.

XXIV.1.7 KRITÉRIA JAKOSTI

XXIV.1.7.1 Výtěžnost
Extrakce a analýza provedená alespoň u dvou duplikátních vzorků systému voda-sediment ihned po přidání zkoušené látky poskytne první informaci o opakovatelnosti analytické metody a o stejnoměrnosti aplikace zkoušené látky. Výtěžnosti pozdějších stupňů experimentu se zjistí z příslušných látkových bilancí (pokud se použije značený materiál). Výtěžnosti by se měly nacházet v rozmezí 90 % až 110 % u značených chemických látek (viz literatura 6) a v rozmezí 70 % až 110 % u neznačených chemických látek.

XXIV.1.7.2 Opakovatelnost a citlivost analytické metody
Opakovatelnost analytické metody (kromě účinnosti první extrakce) pro kvantitativního stanovení zkoušené látky a transformačních produktů lze ověřit provedením analýzy duplikátních vzorků týchž extraktů vzorků vody nebo sedimentu, které byly dostatečně dlouho inkubovány, aby došlo k vytvoření transformačních produktů.
Mez detekce analytické metody (LOD) pro zkoušenou látku a pro transformační produkty by měla být alespoň 0,01 mg na kg vody nebo sedimentu (pro zkoušenou látku) nebo 1 % výchozího množství aplikovaného do zkušebního systému, podle toho, která z hodnot je nižší. Rovněž by měla být specifikována mez kvantitativní stanovitelnosti (LOQ).

XXIV.1.7.3 Správnost dat o transformaci
Regresní analýza závislosti koncentrace zkoušené látky na čase poskytuje vhodné informace o správnosti transformační křivky a umožňuje vypočítat intervaly spolehlivosti pro poločasy (v případě zdánlivé kinetiky prvního řádu) nebo pro hodnoty DT50 a popřípadě hodnoty DT75 a DT90.

XXIV.1.8 POPIS METODY

XXIV.1.8.1 Zkušební systém a aparatura
Studie se provede se skleněnými nádobami (např. baňkami, centrifugačními kyvetami), pokud z předběžných informací (např. z rozdělovacího koeficientu n-oktanol/voda, ze sorpčních dat atd.) nevyplývá, že látka může ulpívat na skle; v takovém případě lze zvážit použití náhradního materiálu (např. teflonu). Pokud je o zkoušené látce známo, že ulpívá na skle, lze problém zmírnit jednou z následujících metod:
— stanovením hmotnosti zkoušené látky a transformačních produktů sorbovaných na skle;
— zajištěním, aby se na konci zkoušky omylo rozpouštědlem veškeré laboratorní sklo;
— použitím komerční úpravy přípravků (viz také oddíl 1.9.2);
— použitím většího množství pomocného rozpouštědla za účelem přidání zkoušené látky do systému; pokud se použije pomocné rozpouštědlo, nesmí štěpit zkoušenou látku solvolýzou.
Příklady typických zkušebních aparatur, tj. průtokové a biometrické systémy, jsou uvedeny v dodatcích 2 a 3 (viz literatura 14). Jiné užitečné inkubační systémy jsou popsány v literatuře (viz literatura 15). Experimentální aparatura by měla být konstruována tak, aby byla možná výměna vzduchu nebo dusíku a zachycení těkavých produktů. Rozměry aparatury musí splňovat požadavky zkoušky (viz oddíl 1.9.1). Ventilace musí být zajištěna buď jemným probubláváním, nebo proháněním vzduchu nebo dusíku nad hladinou vody. V druhém případě se doporučuje vodu seshora mírně promíchávat, aby docházelo k lepší distribuci kyslíku nebo dusíku ve vodě. Neměl by se použít vzduch zbavený CO2, neboť by došlo ke zvýšení pH vody. V žádném případě není žádoucí, aby došlo ke zvíření sedimentu, a je tomu třeba pokud možno zabránit. Slabě těkavé chemické látky se zkoušejí v biometrickém systému za mírného promíchávání vodní hladiny. Lze rovněž použít uzavřené nádobky s volným objemem pod víčkem vyplněným atmosférickým vzduchem nebo dusíkem a vnitřní ampulky pro zachycování těkavých produktů (viz literatura 16). U aerobních zkoušek je nezbytná pravidelná výměna plynu pod víčkem, aby se vyrovnávala spotřeba kyslíku biomasou.
Mezi vhodné lapače pro shromažďování těkavých transformačních produktů patří kromě jiných roztok hydroxidu draselného nebo sodného o koncentraci 1 mol∙dm-3 pro zachytávání oxidu uhličitého a ethylenglykol, ethanolamin nebo 2% parafín v xylenu pro organické sloučeniny. Vzhledem k tomu, že alkalické roztoky absorbují oxid uhličitý ze vzduchu určeného k provzdušňování a oxid uhličitý uvolňující se respirací v aerobních experimentech, musí být pravidelně vyměňovány, aby se nevyčerpala jejich absorpční kapacita. Těkavé látky tvořící se za anaerobních podmínek, např. methan, lze zachytávat na molekulovém sítu. Takové těkavé látky lze spálit např. na CO2 v křemenné trubičce za přítomnosti CuO při teplotě 900 °C a vzniklý CO2 lze zachytit v absorbéru s alkálií (viz literatura 17).
Pro chemickou analýzu zkoušené látky a transformačních produktů jsou nezbytné laboratorní přístroje (např. přístroje pro plynovou chromatografii s kapalinovou stacionární fází (GLC), vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii (HPLC), pro chromatografii na tenké vrstvě (TLC), hmotnostní spektrometrii (MS), kombinaci plynové chromatografie a hmotnostní spektrometrie (GC-MS), kombinaci kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie (LC-MS), jadernou magnetickou rezonanci (NMR) atd.), včetně detekčních systémů pro detekci sloučenin značených nebo neznačených radioisotopy. Pokud se použije materiál značený radioisotopy, je třeba mít k dispozici scintilační spektrometr a zařízení pro spalování za přítomnosti oxidačního činidla (pro spalování vzorků sedimentů před radiometrickým měřením).
Další standardní laboratorní vybavení pro fyzikálně-chemická a biologická stanovení (viz oddíl 1.8.2.2 tabulka 1), laboratorní sklo, chemikálie a činidla se použijí podle potřeby.

XXIV.1.8.2 Výběr a počet vodních sedimentů
Místa odběru by měla být vybrána podle účelu zkoušky v dané situaci. Při výběru místa odběru vzorků musí být přihlédnuto k historii případných zemědělských, průmyslových nebo komunálních vstupů do povodí a do vod proti proudu. Sedimenty by neměly být použity, pokud byly v předchozích 4 letech kontaminovány zkoušenou látkou nebo jejími strukturními analogy.

XXIV.1.8.2.1 Výběr sedimentů
Pro aerobní studie se obvykle použijí dva sedimenty (viz literatura 7). Tyto dva vybrané sedimenty by se měly lišit co do obsahu organického uhlíku a textury. Jeden sediment by měl mít vysoký obsah organického uhlíku (2,5 - 7,5 %) a jemnou texturu a druhý sediment by měl mít nízký obsah organického uhlíku (0,5 – 2,5 %) a hrubou texturu. Obsah organického uhlíku by se měl zpravidla lišit alespoň o 2 %. „Jemná textura“ je definována obsahem složky [jíl + prach], ([jíl + prach] je minerální frakce sedimentu s velikostí částic < 50 μm) vyšším než 50 % a „hrubá textura“ je definována obsahem složky [jíl + prach] nižším než 50 %. Rozdíl v obsahu složek [jíl + prach] u obou sedimentů by měl být zpravidla alespoň 20 %. V případě, že se může chemikálie dostat do mořských vod, měl by alespoň jeden systém voda-sediment pocházet z moře.
Pro přísně anaerobní studii by měly být odebrány dva sedimenty (včetně příslušné vody) z anaerobních zón povrchových vod (viz literatura 7). Se sedimentem i vodní fází by mělo být zacházeno opatrně a měly by být přepravovány s vyloučením přístupu kyslíku.
Pro výběr sedimentu mohou být důležité i jiné parametry, které by měly být zvažovány případ od případu. Rozpětí pH sedimentů je například důležité pro zkoušení chemikálií, u nichž transformace a/nebo sorpce mohou záviset na pH. Závislost sorpce na pH by se mohla odrážet v hodnotě pKa zkoušené látky.

XXIV.1.8.2.2 Charakterizace vzorků systému voda-sediment
Klíčové parametry, které musí být jak u vody, tak u sedimentu měřeny a uvedeny ve zprávě (s odkazem na použitou metodu), a fáze zkoušky, ve které mají být měřeny, jsou shrnuty v níže uvedené tabulce. Metody stanovení těchto parametrů jsou pro informaci uvedeny v literatuře 18 až 21.
Kromě toho může být případ od případu nezbytné měřit a uvádět další parametry (např. u sladkovodního systému: obsah částic, alkalita, tvrdost, vodivost, NO3/PO4 (poměr jednotlivých hodnot); u sedimentů: kationtová výměnná kapacita, retenční vodní kapacita, obsah uhličitanů, celkový obsah dusíku a fosforu; u mořských systémů: salinita). Pro posouzení oxidačně-redukčních podmínek, a zejména v souvislosti s anaerobní transformací, může být také užitečná analýza sedimentů a vody na dusičnany, sírany, biologicky dostupné železo, popřípadě na jiné akceptory elektronů.
Měření parametrů pro charakterizaci vzorků systémů voda-sediment (viz literatura 7, 22 a 23)

ParametrFáze zkušebního postupu
odběr v terénumanipulace po odběruzahájení aklimatizacezahájení zkouškysamotná zkouškakonec zkoušky
Voda
Původ/zdrojx
Teplotax
pHxxxxx
TOCxxx
Koncentrace O2*xxxxx
Oxidačně-redukční potenciál*xxxx
Sediment
Původ/zdrojx
Hloubka vrstvyx
pHxxxxx
Distribuce částicx
TOCxxxx
Mikrobiální biomasa**xxx
Oxidačně-redukční potenciál*Pozorování (barva/zápach)xxxx

* Výsledky nedávných výzkumů ukázaly, že měření koncentrace kyslíku ve vodě a oxidačně-redukčního potenciálu vody nemají vypovídací hodnotu, pokud jde o mechanismus růstu a vývoje mikrobiální populace v povrchových vodách, a nemají ani předpovědní hodnotu (viz literatura 24 a 25). Stanovení biochemické spotřeby kyslíku (BOD, při odběru vzorků v terénu a při zahájení a na konci zkoušky) a koncentrace mikro- a makroživin Ca, Mg a Mn ve vodě (při zahájení a na konci zkoušky) a měření celkového obsahu N a P v sedimentech (při odběru vzorků v terénu a na konci zkoušky) může být lepším nástrojem pro interpretaci a hodnocení rychlosti a způsobů aerobní biotransformace.
** Metoda měření rychlosti mikrobiální respirace (viz literatura 26), fumigační metoda (viz literatura 27) nebo měření počtu mikroorganismů (např. bakterií, aktinomycet, plísní a celkového počtu kolonií) pro aerobní studie; rychlost methanogeneze u anaerobních studií.

XXIV.1.8.3 Odběr vzorků, manipulace s nimi a jejich skladování

XXIV.1.8.3.1 Odběr
Vzorky sedimentu se odeberou podle návrhu směrnice ISO pro odběr vzorků sedimentů (viz literatura 8). Vzorky se odeberou z celé 5 až 10 cm silné horní vrstvy sedimentu. Současně se sedimentem se odebere z téhož místa nebo lokality příslušný vzorek vody. U anaerobní studie musí být sediment a příslušná voda odebrány a přepravovány s vyloučením přístupu kyslíku (viz literatura 28) (viz oddíl 1.8.2.1). V literatuře je popsáno několik odběrových zařízení (viz literatura 8 a 23).

XXIV.1.8.3.2 Manipulace
Sediment se oddělí od vody filtrací a poté se pomocí přebytku vody z místa odběru prosévá za mokra na 2mm sítu; voda se odstraní. Poté se v inkubační baňce v požadovaném poměru (viz oddíl 1.9.1) smísí známé množství sedimentu a vody a směs se připraví pro aklimatizaci (viz oddíl 1.8.4). U anaerobní studie musí být všechny kroky prováděny s vyloučením přístupu kyslíku (viz literatura 29 až 33).

XXIV.1.8.3.3 Skladování
V každém případě se doporučuje používat čerstvě odebraný sediment a vodu; je-li však skladování nezbytné, sediment s vodou se proseje výše popsaným způsobem a zalitý vodou (vrstva vody 6 – 10 cm) se skladuje v temnu při (4 ± 2) °C (viz literatura 4) maximálně 4 týdny (viz literatura 7, 8 a 23). Vzorky pro aerobní studie se skladují za volného přístupu vzduchu (např. v otevřených nádobách), zatímco vzorky pro anaerobní studie se skladují s vyloučením přístupu kyslíku. Při přepravě a skladování nesmí sediment a voda zmrznout a sediment nesmí být vysušován.

XXIV.1.8.4 Příprava vzorků systému sediment-voda ke zkoušce
Před přidáním zkoušené látky musí proběhnout aklimatizace, při níž musí být vzorky sedimentu-vody umístěny v inkubační nádobě, která se použije při hlavní zkoušce; podmínky aklimatizace musí být totožné s podmínkami inkubace při zkoušce (viz oddíl 1.9.1). Doba aklimatizace je čas nezbytný pro dostatečnou stabilizaci systému, kterou lze posoudit podle pH, koncentrace kyslíku ve vodě, oxidačně-redukčního potenciálu sedimentu a vody a makroskopické separace fází. Doba aklimatizace není obvykle delší než jeden až dva týdny a neměla by překročit čtyři týdny. Výsledky měření provedených během této doby se uvedou ve zprávě.

XXIV.1.9 PROVEDENÍ ZKOUŠKY

XXIV.1.9.1 Zkušební podmínky
Zkouška se provede v inkubační aparatuře (viz oddíl 1.8.1) při poměru objemu vody a sedimentu 3:1 až 4:1, s vrstvou sedimentu 2,5 cm (± 0,5 cm). Doporučené minimální množství sedimentu na inkubační nádobu je 50 g (hmotnost sušiny). Z nedávných studií vyplývá, že skladování při 4 °C může vést k poklesu obsahu organického uhlíku v sedimentu, který by mohl případně vést k poklesu mikrobiální aktivity.
Zkouška se provádí v temnu za konstantní teploty v rozmezí 10 až 30 °C. Vhodná je teplota (20 ± 2) °C. Podle potřeby lze případ od případu v závislosti na zaměření zkoušky zvolit další, nižší teplotu (např. 10 °C). Inkubační teplota se sleduje a uvede se ve zprávě.

XXIV.1.9.2 Úprava zkoušené látky a její aplikace
Použije se jedna zkušební koncentrace chemické látky. Zkouška s druhou koncentrací může být užitečná u chemických látek, které se dostávají do vod různými cestami, a vykazují tedy významně odlišné koncentrace, pokud lze nižší koncentraci analyzovat s dostatečnou správností. U přípravků na ochranu rostlin aplikovaných přímo do vodního tělesa se použije maximální dávkování uvedené na etiketě jako maximální aplikovaná dávka vypočtená podle plochy hladiny vody ve zkušební nádobě. Ve všech ostatních případech se použije koncentrace založená na odhadech emise do životního prostředí. Je třeba spolehlivě zajistit, aby byla aplikována dostatečná koncentrace zkoušené látky pro charakterizaci postupu transformace a tvorby a odbourávání transformačních produktů. V situaci, kdy se koncentrace zkoušené látky na začátku studie blíží mezím detekce a/nebo kdy by nebylo možné detekovat hlavní transformační produkty, jsou-li přítomny v množství odpovídajícím 10 % výchozí aplikované dávky, může být nezbytné aplikovat vyšší dávky (např. 10krát vyšší). Použité vyšší koncentrace však nesmí mít významné nepříznivé účinky na mikrobiální aktivitu v systému voda-sediment. S cílem dosáhnout konstantní koncentrace v nádobách různých rozměrů může být nezbytné upravit množství použitého materiálu, přičemž se vychází z výšky vodního sloupce v nádobě v poměru k hloubce vody v odběrovém místě (předpokládá se hloubka 100 cm, možná je však i jiná hloubka). Příklad výpočtu je uveden v dodatku 4.
V ideálním případě se zkoušená látka aplikuje do vodné fáze zkoušeného systému ve formě vodného roztoku. Je-li to nevyhnutelné, je přípustné použít pro aplikaci a rozptýlení zkoušené látky malé množství rozpouštědla mísitelného s vodou (např. acetonu nebo ethanolu), avšak jeho množství by nemělo překročit 1 % (obj.) a rozpouštědlo by nemělo mít nepříznivé účinky na mikrobiální aktivitu ve zkušebním systému. Přípravě vodného roztoku zkoušené látky je třeba věnovat pozornost a k zajištění naprosté homogenity může být vhodné použít generátorové kolony a předem připravené směsi. Po přidání vodného roztoku do zkušebního systému se doporučuje vodnou fázi mírně promíchat tak, aby se sediment zvířil co nejméně.
Použití komerčních úprav přípravků se nedoporučuje, neboť složky přípravku mohou mít vliv na distribuci zkoušené látky a/nebo transformačních produktů mezi vodu a sediment. U špatně rozpustných zkoušených látek však může být použití komerční úpravy vhodnou možností.
Počet inkubačních nádob závisí na počtu intervalů, v nichž mají být prováděny odběry (viz oddíl 1.9.3). Je třeba nasadit dostatečný počet zkušebních systémů, aby bylo možné v každém intervalu vyhodnotit dva systémy. Použijí-li se pro každý systém voda-sediment kontrolní systémy, neexponují se zkoušené látce. Kontrolní systémy lze použít pro stanovení mikrobiální biomasy sedimentu a celkového organického uhlíku ve vodě na konci studie. Dva kontrolní systémy (tj. po jednom kontrolním systému z každého systému voda-sediment) mohou být použity pro sledování požadovaných parametrů v sedimentu a ve vodě v průběhu aklimatizace (viz tabulka v oddílu 1.8.2.2). Dva další kontrolní systémy musí být nasazeny za účelem měření nepříznivých účinků na mikrobiální aktivitu ve zkušebním systému v případě, že se zkoušená látka aplikuje pomocí rozpouštědla.

XXIV.1.9.3 Délka zkoušky a odběry vzorků
Délka experimentu by neměla překročit 100 dnů (6) a experiment by měl trvat tak dlouho, dokud se nestanoví způsob rozkladu a distribuce ve vodě/sedimentu, nebo dokud se transformací a/nebo těkáním nevyčerpá 90 % zkoušené látky. Odběr by měl být proveden nejméně v šesti časech (včetně času 0), přičemž vhodný režim odběrů a délka zkoušky se stanoví nepovinnou orientační studií (viz oddíl 1.9.4), nejsou-li k dispozici vhodné údaje o zkoušené látce z dřívějších studií. U hydrofobních zkoušených látek může být potřeba dodatečným vzorkováním v průběhu počáteční fáze studie zjistit stupeň distribuce mezi vodu a sediment.
V příslušnou dobu se k analýze odebere celý obsah inkubačních nádob (včetně duplikátních nádob). Sediment a voda nad sedimentem se analyzují zvlášť. Může-li snadno docházet k rychlé opětovné oxidaci produktů anaerobní transformace, měly by být během odběru a analýzy zachovány anaerobní podmínky.
Voda se za minimálního zvíření sedimentu opatrně odebere. Vhodnými analytickými postupy se provedou extrakce a charakterizace zkoušené látky a transformačních produktů. Je třeba také pečlivě shromáždit materiál, který může být adsorbován na inkubační nádobě nebo ve spojovacích trubičkách použitých k zachycení těkavých látek.

XXIV.1.9.4 Nepovinná orientační zkouška
Pokud nelze délku etapy, kdy jsou odebírány vzorky, odhadnout z jiných relevantních studií zkoušené látky, lze případně provést orientační zkoušku, která se provede za týchž zkušebních podmínek, jaké jsou navrženy pro hlavní studii. Příslušné podmínky a výsledky orientační zkoušky, pokud byla provedena, by měly být v krátkosti uvedeny ve zprávě.

XXIV.1.9.5 Měření a analýza
Pro každý čas odběru se provede měření koncentrace zkoušené látky a transformačních produktů ve vodě a v sedimentu a výsledky se uvedou ve zprávě (jako koncentrace a v procentech aplikovaného množství). V zásadě by měla být při každém odběru provedena identifikace transformačních produktů, které obsahují ≥ 10 % radioaktivity aplikované do celého systému voda-sediment, pokud nejsou dostatečné důvody proti tomu. Měly by být také identifikovány transformační produkty, jejichž koncentrace v průběhu studie nepřetržitě roste, třebaže nedosahuje výše uvedené meze, neboť to může znamenat, že se jedná o perzistentní produkty. Tento postup by měl být zvážen případ od případu a ve zprávě by měl být odůvodněn.
Pro každý čas odběru se uvedou výsledky ze systémů pro zachycování plynů/těkavých látek (CO2 a jiných těkavých organických sloučenin). Uvede se rychlost mineralizace. Pro každý čas odběru se uvedou neextrahovatelná (vázaná) rezidua v sedimentu.

XXIV.2. DATA

XXIV.2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKŮ
Pro každý čas odběru se vypočte celková látková bilance nebo výtěžnost (viz oddíl 1.7.1) přidané radioaktivity. Výsledky se uvedou v procentech přidané radioaktivity. Pro každý čas odběru se uvede distribuce radioaktivity mezi vodu a sediment (vyjádřeno v koncentracích a v procentech).
Pro zkoušenou látku se vypočítá poločas a hodnoty DT50 a popřípadě hodnoty DT75 a DT90 a intervaly spolehlivosti těchto hodnot (viz oddíl 1.7.3). Vhodnými hodnotícími nástroji lze zjistit míru zániku zkoušené látky ve vodě a v sedimentu. Může jít o použití zdánlivé kinetiky prvního řádu, o techniky proložení empirické křivky za použití grafického nebo numerického řešení a o složitější hodnocení, např. pomocí modelu s jednou nebo více složkami. Další podrobné informace lze získat z publikované literatury 35 až 37).
Všechny přístupy mají své silné a slabé stránky a značně se liší v komplexnosti. Předpoklad kinetiky prvního řádu může být sice přílišným zjednodušením procesu rozkladu a distribuce, vede však v ideálním případě k hodnotám (rychlostní konstantě nebo poločasu), které jsou snadno srozumitelné a mají význam pro simulační modelování a výpočet předpokládaných koncentrací v životním prostředí. Empirický přístup nebo lineární transformace mohou vést k lepšímu proložení dat křivkami, a tedy k lepšímu odhadu poločasů, hodnot DT50 a popřípadě DT75 a DT90. Použití odvozených konstant však má své meze. Složkové modely mohou poskytovat řadu užitečných konstant, které jsou důležité pro posouzení rizika a pro popis rozkladu chemické látky v různých složkách a pro její distribuci. Použijí se rovněž pro odhad rychlostních konstant tvorby a rozkladu hlavních transformačních produktů. V každém případě však musí být volba metody odůvodněna a experimentátor by měl graficky nebo statisticky prokázat její oprávněnost.

XXIV.3. ZPRÁVY

XXIV.3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE
Protokol musí obsahovat následující informace:
Zkoušená látka:
— obecný název, chemický název, číslo CAS, strukturní vzorec (s uvedením polohy značícího nuklidu u látek značených radionuklidy) a relevantní fyzikálně-chemické vlastnosti;
— čistota zkoušené látky (obsah nečistot);
— popřípadě radiochemická čistota značené chemické látky a molární aktivita.
Referenční látky:
— chemický název a struktura referenčních látek použitých k charakterizaci a/nebo identifikaci transformačního produktu.
Zkušební sedimenty a vody:
— lokalita a popis odběrového místa (odběrových míst) sedimentu a vody, pokud možno včetně dřívější kontaminace;
— všechny informace týkající se odběru, případného skladování a aklimatizace systému voda-sediment;
— charakteristiky vzorků systému voda-sediment, jak jsou uvedeny v tabulce v oddílu 1.8.2.2.
Zkušební podmínky:
— použitý zkušební systém (např. průtokový systém, biometrický systém, způsob provzdušňování, způsob míchání, objem vody, hmotnost sedimentu, tloušťka vrstvy vody i sedimentu, rozměry zkušebních nádob atd.);
— aplikace zkoušené látky do systému: použitá zkušební koncentrace, počet duplikátních vzorků a kontrol, způsob aplikace zkoušené látky (např. případné použití rozpouštědla) atd.
— inkubační teplota;
— doby odběru;
— metody extrakce a účinnosti extrakce, analytické metody a meze detekce;
— metody charakterizace/identifikace transformačních produktů;
— odchylky od zkušebního postupu nebo zkušebních podmínek.
Výsledky:
— původní číselná data reprezentativních analýz (všechna původní data musí být uložena v archivu vedeném podle zásad správné laboratorní praxe);
— opakovatelnost a citlivost použitých analytických metod;
— hodnoty výtěžnosti (hodnoty v % pro platnou studii jsou uvedeny v oddíle 1.7.1);
— výsledky pro zkoušenou látku, popřípadě i pro transformační produkty a neextrahovatelnou radioaktivitu, zpracované v tabulkové formě a vyjádřené v % aplikované dávky a v mg∙kg-1 pro vodu, sediment a celý systém (pouze v %);
— látková bilance během studií na jejich konci;
— grafické schéma transformace ve vodě a sedimentu a v celém systému (včetně mineralizace);
— rychlosti mineralizace;
— poločas, hodnoty DT50 a popřípadě DT75 a DT90 pro zkoušenou látku, popřípadě i pro hlavní transformační produkty, včetně intervalů spolehlivosti, pro vodu, sediment a celý systém;
— charakteristika kinetiky transformace zkoušené látky, popřípadě i hlavních transformačních produktů;
— případný návrh způsobu transformace;
— diskuse o výsledcích.

XXIV.4. LITERATURA

(1) BBA-Guidelines for the examination of plant protectors in the registration process. (1990). Part IV, Section 5-1: Degradability and fate of plant protectors in the water/sediment system. Germany.

(2) Commission for registration of pesticides: Application for registration of a pesticide. (1991). Part G. Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air, Section G.2.1 (a). The Netherlands.

(3) MAFF Pesticides Safety Directorate. (1992). Preliminary guideline for the conduct of biodegradability tests on pesticides in natural sediment/water systems. Ref No SC 9046. United Kingdom.

(4) Agriculture Canada: Environmental chemistry and fate. (1987). Guidelines for registration of pesticides in Canada. Aquatic (Laboratory) – Anaerobic and aerobic. Canada. 35 – 37.

(5) US-EPA: Pesticide assessment guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental fate (1982). Section 162 – 3, Anaerobic aquatic metabolism.

(6) SETAC-Europe publication. (1995). Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity of pesticides. Vyd. Dr. Mark R. Lynch. SETAC-Europe, Brussels.

(7) OECD Test Guidelines Programme. (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/sediments, Belgirate, Italy, 18. – 20. ledna 1995.

(8) ISO 5667-12. (1995). Water quality – Sampling – Part 12: Guidance on sampling of bottom sediments, Technical Committee ISO/TC 146/SC 6.

(9) US-EPA (1998a). Sediment/water microcosm biodegradation test. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3180). EPA 712-C-98-080.

(10) DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley-VCH (1998).

(11) T. R. Roberts: Non-extractable pesticide residues in soils and plants. Pure Appl. Chem. 56, 945-956 (IUPAC 1984).

(12) OECD Test Guideline 304A: Inherent Biodegradability in Soil (přijato 12. května 1981).

(13) OECD (1993): Guidelines for Testing of Chemicals. Paris. OECD (1994-2000): Addenda 6-11 to Guidelines for the Testing of Chemicals.

(14) Scholz, K., Fritz R., Anderson C., Spiteller M. (1988) Degradation of pesticides in an aquatic model ecosystem. BCPC – Pests and Diseases, 3B-4, 149 – 158.

(15) Guth, J. A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In: Progress in Pesticide Biochemistry. Vyd. D. H. Hutson, T. R. Roberts, J. Wiley &amp; Sons, Vol. 1, 85 – 114.

(16) Madsen, T., Kristensen, P. (1997). Effects of bacterial inoculation and non-ionic surfactants on degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in soil. Environ. Toxicol. Chem. 16, 631 – 637.

(17) Steber, J., Wierich, P. (1987). The anaerobic degradation of detergent range fatty alcohol ethoxylates. Studies with 14C-labelled model surfactants. Water Research 21, 661 – 667.

(18) Black, C. A. (1965). Methods of Soil Analysis. Agronomy Monograph No. 9. American Society of Agronomy, Madison.

(19) APHA (1989). Standard Methods for Examination of Water and Wastewater (17. vyd.). American Public Health Association, American Water Works Association and Water Pollution Control Federation, Washington D.C.

(20) Rowell, D. L. (1994). Soil Science Methods and Applications. Longman.

(21) Light, T. S. (1972). Standard solution for redox potential measurements. Anal. Chem. 44, 1038 – 1039.

(22) SETAC-Europe publication (1991). Guidance document on testing procedures for pesticides in freshwater mesocosms. From the Workshop „A Meeting of Experts on Guidelines for Static Field Mesocosms Tests“, 3. – 4. června 1991.

(23) SETAC-Europe publication. (1993). Guidance document on sediment toxicity tests and bioassays for freshwater and marine environments. From the Workshop „On Sediment Toxicity Assessment (WOSTA)“, 8. – 10. listopadu 1993. Vyd. I. R. Hill, P. Matthiessen, F. Heimbach.

(24) Vink, J. P. M., van der Zee, S. E. A. T. M. (1997). Pesticide biotransformation in surface waters: multivariate analyses of environmental factors at field sites. Water Research 31, 2858 – 2868.

(25) Vink, J. P. M., Schraa, G., van der Zee, S. E. A. T. M. (1999). Nutrient effects on microbial transformation of pesticides in nitrifying waters. Environ. Toxicol, 329 – 338.

(26) Anderson, T. H., Domsch, K. H. (1985). Maintenance carbon requirements of actively-metabolising microbial populations under in-situ conditions. Soil Biol. Biochem. 17, 197 – 203.

(27) ISO-14240-2. (1997). Soil quality – Determination of soil microbial biomass – Part 2: Fumigation-extraction method.

(28) Beelen, P. Van, F. Van Keulen. (1990), The Kinetics of the Degradation of Chloroform and Benzene in Anaerobic Sediment from the River Rhine. Hydrobiol. Bull. 24 (1), 13 – 21.

(29) Shelton, D. R., Tiedje, J. M. (1984). General method for determining anaerobic biodegradation potential. App. Environ. Microbiol. 47, 850 – 857.

(30) Birch, R. R., Biver, C., Campagna, R., Gledhill, W. E., Pagga, U., Steber, J., Reust, H., Bontinck, W. J. (1989). Screening of chemicals for anaerobic biodegradation. Chemosphere, 19, 1527 – 1550.

(31) Pagga, U., Beimborn, D. B. (1993). Anaerobic biodegradation tests for organic compounds. Chemosphere, 27, 1499 – 1509.

(32) Nuck, B. A., Federle, T. W. (1986). A batch test for assessing the mineralisation of 14C-radiolabelled compounds under realistic anaerobic conditions. Environ. Sci. Technol. 30, 3597 – 3603.

(33) US-EPA (1998b). Anaerobic biodegradability of organic chemicals. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3400). EPA 712-C-98-090.

(34) Sijm, Haller, Schrap (1997). Influence of storage on sediment characteristics and drying sediment on sorption coefficients of organic contaminants. Bulletin Environ. Contam. Toxicol. 58, 961 – 968.

(35) Timme, G., Frehse, H., Laska, V. (1986) Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues II. Pflanzenschutz - Nachrichten Bayer, 39, 187 – 203.

(36) Timme, G., Frehse, H. (1980) Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues I. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer, 33, 47 – 60.

(37) Carlton, R.R., Allen, R. (1994). The use of a compartment model for evaluating the fate of pesticides in sediment/water systems. Brighton Crop Protection Conference – Pest and Diseases, 1349 – 1354.