b) Metoda s cetylpyridinium chloridem (CPC):
Postup stanovení:
Membránovou filtrací (filtr o porozitě 0,45 mikrometrů) se zpracuje s pomocí vodní vývěvy 1 litr vody. Pro dekontaminaci vzorku vody se použije roztok CPC ve výsledné koncentraci 0,005 %, který se připraví do sterilní destilované vody.
Dekontaminace vzorku vody je provedena následujícím způsobem: 1 díl 0,05 % roztoku CPC je přidán k 9 dílům vzorku vody. Po uzavření láhve se její obsah po dobu 30 sekund protřepává, pak se nechá 30 minut stát. Poté se ihned provede filtrace přes celulózový membránový filtr o průměru 50 mm a velikosti pórů 0,45 μm.
Filtr je propláchnut po ukončení filtrace 500 ml sterilní destilované vody, aby se odstranila residua CPC.
Filtr se vyjme sterilní pinzetou a vloží do sterilní 30 ml plastikové nádobky, do níž jsou přidány 2 ml sterilní destilované vody. Na vortexu je plastiková nádobka protřepána po dobu 10 vteřin. Na povrch půd v Petriho miskách je suspenze inokulována po 0,2 ml a 0,1 ml je použita k nátěru na podložní sklíčko pro barvení metodou podle Ziehl-Neelsena. Kultivace na jedné Petriho misce s Löwenstein-Jensenovou půdou a jedné Petriho misce s Ogawovou půdou při 30 °C, 37 °C a 42 °C. Hodnocení se provádí 1x týdně do 9 týdnů inkubace.
Do protokolu se zaznamenávají zjištěné výsledky na jednotlivých půdách: počet kolonií na půdě, při masivním růstu na výseči s reprezentativním nárůstem, morfologie kolonií, mikroskopické ověření vyrostlých kolonií. Pokud je zjištěn růst více mykobakteriálních druhů, uvádí se počet každého druhu zvlášť. Pro identifikaci je odebráno 10 kolonií, z nichž je připravena subkultura na pevné půdě (Löwenstein-Jensenově nebo Ogawově) pro provedení identifikačních testů. U některých suspektních kolonií mykobakterií je možno provést vyšetření GEN Probe přímo z primokultury z dostatečného inokula. Konečné hodnocení růstu je provedeno po 9 týdnech inkubace, stejně tak uzavření negativních vyšetření; u negativních se inkubace prodlouží do 12 týdnů. Pokud v průběhu šestitýdenní inkubace přerostou všechny naočkované půdy nespecifickou bakteriální flórou, uzavře se výsledek dříve.
Pro stanovení počtů se použijí výsledky po 9 týdnech inkubace, popřípadě po 12 týdnech inkubace, pokud po 9 týdnech bylo vyšetření negativní. V případě, že kmen neroste při určité teplotě, se výsledky počítají jen z údajů těch teplot inkubace, při nichž je kmen schopen růst. Počty kolonií mykobakterií na 1 litr vody se vypočítají ve vztahu k objemu přefiltrované vody, objemu vzorku při vytřepávání filtru, velikosti očkovaného inokula a počtu inokulovaných ploten.