3. Detekce a identifikace původce hnědé hniloby ve vzorcích hlíz bramboru

3.1. Podrobné metody pro detekci a identifikaci Ralstonia solanacearum ve vzorcích bezpříznakových hlíz bramboru

3.1.1. Příprava vzorků
Poznámka:
- Standardní velikost vzorku je 200 hlíz na jeden test. Intenzivnější vzorkování vyžaduje více testů na vzorcích této velikosti. Větší množství hlíz ve vzorku vede k zpomalení nebo složitějšímu výkladu výsledků. Postup lze vhodně použít i pro vzorky s méně než 200 hlízami, pokud je k dipozici menší množství hlíz.
- Validace všech níže uvedených zjišťovacích metod je založená na testování vzorků o velikosti 200 hlíz.
- Extrakt bramboru popsaný níže může být rovněž použit pro zjištění původce bakteriální kroužkovitosti bramboru. Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.
Nepovinné ošetření před přípravou vzorku

a) Inkubace vzorků při teplotě 2-30°C po dobu až 2 týdnů před testováním na podporu množení všech populací R. solanacearum.

b) Hlízy se omyjí. Použijí se vhodné desinfekční prostředky (s obsahem chlóru, jestliže má být proveden PCR test, pro odstranění patogenní DNA) a mycí prostředky mezi každým vzorkem. Hlízy se nechají oschnout na vzduchu. Tento postup mytí je vhodný zvláště v případě, když je ve vzorcích příliš zeminy nebo jestliže má být proveden test PCR nebo přímá izolace.

3.1.1.1. Pomocí čistého a dezinfikovaného skalpelu nebo nože na zeleninu se odstraní slupka na pupkovém konci každé hlízy, tak aby bylo viditelné vodivé pletivo. Opatrně se vyříznou malé výkrojky vodivých pletiv na pupkovém konci. Množství pletiva nezahrnující cévní svazky se omezí na minimum.
Poznámka:
Všechny (hnijící) hlízy s podezřelými příznaky hnědé hniloby se dají stranou a testují se odděleně.
Pokud jsou při vyříznutí výkrojku zjištěny příznaky podezření na hnědou hnilobu, provede se vizuální vyšetření takové hlízy na řezu hlízy na pupkovém konci. Všechny naříznuté hlízy s podezřelými příznaky se uchovávají po dobu nejméně 2 dnů při pokojové teplotě, aby mohlo dojít ke zkorkovatění (suberizaci) a potom se uchovávají v chladu (4-10°C) za řádných karanténních podmínek. Všechny hlízy včetně hlíz s podezřelými příznaky by měly být uchovány podle přílohy III.

3.1.1.2. Výkrojky z pupkové části se uloží do nepoužitých nádob na jedno použití, které jsou uzavíratelné a/nebo utěsnitelné (v případě, že nádoby jsou znovu používány, musí být důkladně vyčištěny a dezinfikovány prostředky s obsahem chlóru). Nejlépe je zpracovat výkrojky z pupkového konce okamžitě. Není-li to možné, uchovávají se v nádobě bez přidání pufru; v chladu nejdéle 72 hodin nebo při pokojové teplotě (18 -25 °C) nejdéle 24 hodin.
Výkrojky z pupkových konců se zpracují jedním z následujících postupů:
nebo
Poznámka:
Při homogenizaci vzorků pomocí mixéru existuje vysoké nebezpečí křížové kontaminace vzorků. Je nutné zamezit vzniku aerosolu nebo rozlití během extrakčního procesu. Pro každý vzorek se použijí čerstvě sterilované nože (ostří) a nádoby. Při testu PCR je nutno zabránit přenosu DNA na nádobách nebo v mlecím přístroji. U testu PCR se doporučuje použít drcení v sáčcích na jedno použití a použití zkumavek na jedno použití.

a) Zalijí se dostatečným množství (přibližně 40 ml) extrakčního pufru (dodatek 4) a třepou se v rotační třepačce (50-100 ot./min) 4 hodiny při teplotě nižší než 24 °C nebo 16-24 hodin chlazené,

b) homogenizují se dostatečným množství (přibližně 40 ml) extrakčního pufru (dodatek 4) buď v mixéru (např. Waring nebo Ultra Thurax) nebo drcením v utěsněném maceračním sáčku na jedno použití (např. silný polyethylenový sáček Stomacher nebo Bioreba, 150mm × 250mm, sterilovaný zářením) pomocí gumového tloučku nebo vhodného mlecího zařízení (např. Homex).

3.1.1.3. Supernatant se dekantuje. Je-li příliš zakalený, pročistí se buď pomalým odstřeďováním (nejvýš 180 g po dobu 10 minut při teplotě 4-10°C) nebo vakuovou filtrací (40-100µm), filtr se omyje přídavkem (10ml) extrakčního pufru.

3.1.1.4. Bakteriální frakce se zahustí odstřeďováním, 7 000g po dobu 15 minut (nebo 10 000g po dobu 10 minut) při teplotě 4-10°C a odstraní se supernatant, aniž by se rozvířila peleta.

3.1.1.5. Peleta se resuspenduje v 1,5 ml peletového pufru (dodatek 4). Použije se 500 µl pro R. solanacearum, 500 µl pro Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus a 500 µl pro referenční účely. Přidá se sterilní glycerol na konečnou koncentraci 10 - 25% (v/v) k 500 µl referenční poměrné části a ke zbývající části vzorku, promíchá se vířením a uloží se při teplotě -16 až -24°C (týdny) nebo -68 až -86°C (měsíce). Extrakty se uchovávají během testování při teplotě 4-10°C.
Opakované zmrazení a rozmrazení se nedoporučuje.
Je-li nutná přeprava extraktu, zajistí se přeprava v chladícím boxu s doručením do 24 až 48 hodin.

3.1.1.6. Je nezbytně nutné, aby všechny pozitivní kontroly a vzorky R. solanacearum byly uchovány a zpracovány odděleně, aby se zabránilo vzájemné kontaminaci. To platí pro sklíčka IF a všechny testy.

3.1.2. Testování
Postupové diagramy a popisy testů a optimalizovaných protokolů jsou v příslušných dodatcích:
Selektivní izolace (viz. oddíl 6.1.4.)
IF test (viz.oddíl 6.1.5.)
Testy PCR (viz. oddíl 6.1.6.)
Test FISH (viz. oddíl 6.1.7.)
Testy ELISA (viz. oddíl 6.1.8.)
Biotest (viz. oddíl 6.1.9.)

3.2. Podrobné metody pro detekci a identifikaci R. solanacearum ve vzorcích bezpříznakových rostlin bramboru, rajčete nebo jiných hostitelských rostlin

3.2.1. Příprava vzorků
Poznámka:
Pro účely detekce latentních populací R. solanacearum se doporučuje testovat smíšené vzorky. Postup lze vhodně použít na smíšené vzorky o počtu až 200 stonkových částí. Provádí-li se průzkum, měl by být založen na statisticky reprezentativním vzorku zkoumané rostlinné populace.

3.2.1.1. Do uzavřené sterilní nádoby se uloží 1-2 cm dlouhé kousky stonků podle následujícího postupu vzorkování:
Rajčatové sazenice z předpěstírny: Čistým dezinfikovaným nožem se odebere kousek dlouhý 1 cm z paty každého stonku hned nad úrovní země.
Rostliny z pole nebo skleníku: Čistým dezinfikovaným nožem se odebere nejspodnější postranní výhonek z každé rostliny uříznutý hned nad spojením s hlavním stonkem. Odebere se nejspodnější, 1 cm dlouhý díl z každého výhonku.
Jiné hostitelské rostliny: Čistým dezinfikovaným nožem nebo zahradnickými nůžkami se odebere 1 cm dlouhý díl z paty každého stonku hned nad úrovní země. U lilku potměchuti (S. dulcamara) nebo jiných hostitelských rostlin rostoucích ve vodě se odeberou 1-2 cm díly ze stonku pod vodou nebo oddenků s vodními kořeny.
Při vzorkování určité oblasti se doporučuje testovat statisticky representativní vzorek o počtu nejméně 10 rostlin na 1 vzorkovací místo pro každou potenciální plevelnou hostitelskou rostlinu. Detekce patogenu bude nejspolehlivější v období pozdního jara, léta a podzimu, ačkoli přirozenou infekci je možné zjistit po celý rok u víceleté Solanum dulcamara rostoucí ve vodních tocích. Mezi známé hostitelské rostliny patří plevelné rostliny bramboru, Solanum dulcamara, S. nigrum, Datura stramonium a další zástupci čeledi Solanaceae. Dalšími hostitelskými rostlinami jsou rostliny rodu Pelargonium spp. a Portulaca oleracea. Některé evropské plevelné druhy, které mohou hostit populace R. solanacearum biovar 2/Race 3 v kořenech a/nebo oddencích za specifických podmínek, zahrnují Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp, Rumex spp., Silene alba, S. nutans., Tussilago farfarra a Urtica dioica.
Poznámka:
V této fázi je možné provést vizuální šetření vnitřních příznaků (zbarvení cév nebo bakteriální sliz). Jakýkoli díl stonku s příznaky se dá stranou a testuje se odděleně (viz. oddíl 2.).

3.2.1.2. Části stonku se krátce dezinfikují 70% etanolem a ihned vysuší savým papírem. Potom se zpracují části stonku jedním z následujících postupů:
nebo

a) zalijí se části dostatečným množstvím (přibližně 40 ml) extrakčního pufru (dodatek 4) a třepou na rotační třepačce (50-100 ot./min) 4 hodiny při teplotě do 24°C nebo 16-24 hodin chlazené,

b) se ihned zpracují drcením v pevném maceračním sáčku (např. Stomacher nebo Bioreba) s přiměřeným množstvím extrakčního pufru (dodatek 4) pomocí gumového tloučku nebo vhodného mlecího zařízení (např. Homex). Není-li to možné, uloží se části stonků v chladu nejdéle na 72 hodin nebo při pokojové teplotě (18 – 25°C) na 24 hodin.

3.2.1.3. Po usazení, které má trvat 15 minut, se dekantuje supernatant.

3.2.1.4. Další pročišťování extraktu nebo zahušťování bakteriální frakce obvykle není třeba, ale lze je provést filtrací a/nebo odstřeďováním popsaným v oddíle 3.1.1.3. až 3.1.1.5.

3.2.1.5. Čistý nebo koncentrovaný vzorkový extrakt se rozdělí na dva stejné díly. Jeden díl se testuje při teplotě 4-10°C a druhý díl se skladuje v 10-25% (v/v) sterilním glycerolu při teplotě -16 až -24°C (týdny) nebo -68 až -86°C (měsíce) pro případné další testování.

3.2.2. Testování
Postupové diagramy a popisy testů a optimalizovaných protokolů jsou v příslušných dodatcích:
Selektivní izolace (viz. oddíl 6.1.4.)
Test IF (viz. oddíl 6.1.5.)
Testy PCR (viz. oddíl 6.1.6.)
Test FISH (viz. oddíl 6.1.7.)
Testy ELISA (viz. oddíl 6.1.8.)
Biotest (viz. oddíl 6.1.9.)