3.1. Podrobné metody pro detekci a identifikaci Ralstonia solanacearum ve vzorcích bezpříznakových hlíz bramboru

3.1.1. Příprava vzorků
Poznámka:
- Standardní velikost vzorku je 200 hlíz na jeden test. Intenzivnější vzorkování vyžaduje více testů na vzorcích této velikosti. Větší množství hlíz ve vzorku vede k zpomalení nebo složitějšímu výkladu výsledků. Postup lze vhodně použít i pro vzorky s méně než 200 hlízami, pokud je k dipozici menší množství hlíz.
- Validace všech níže uvedených zjišťovacích metod je založená na testování vzorků o velikosti 200 hlíz.
- Extrakt bramboru popsaný níže může být rovněž použit pro zjištění původce bakteriální kroužkovitosti bramboru. Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.
Nepovinné ošetření před přípravou vzorku

a) Inkubace vzorků při teplotě 2-30°C po dobu až 2 týdnů před testováním na podporu množení všech populací R. solanacearum.

b) Hlízy se omyjí. Použijí se vhodné desinfekční prostředky (s obsahem chlóru, jestliže má být proveden PCR test, pro odstranění patogenní DNA) a mycí prostředky mezi každým vzorkem. Hlízy se nechají oschnout na vzduchu. Tento postup mytí je vhodný zvláště v případě, když je ve vzorcích příliš zeminy nebo jestliže má být proveden test PCR nebo přímá izolace.

3.1.1.1. Pomocí čistého a dezinfikovaného skalpelu nebo nože na zeleninu se odstraní slupka na pupkovém konci každé hlízy, tak aby bylo viditelné vodivé pletivo. Opatrně se vyříznou malé výkrojky vodivých pletiv na pupkovém konci. Množství pletiva nezahrnující cévní svazky se omezí na minimum.
Poznámka:
Všechny (hnijící) hlízy s podezřelými příznaky hnědé hniloby se dají stranou a testují se odděleně.
Pokud jsou při vyříznutí výkrojku zjištěny příznaky podezření na hnědou hnilobu, provede se vizuální vyšetření takové hlízy na řezu hlízy na pupkovém konci. Všechny naříznuté hlízy s podezřelými příznaky se uchovávají po dobu nejméně 2 dnů při pokojové teplotě, aby mohlo dojít ke zkorkovatění (suberizaci) a potom se uchovávají v chladu (4-10°C) za řádných karanténních podmínek. Všechny hlízy včetně hlíz s podezřelými příznaky by měly být uchovány podle přílohy III.

3.1.1.2. Výkrojky z pupkové části se uloží do nepoužitých nádob na jedno použití, které jsou uzavíratelné a/nebo utěsnitelné (v případě, že nádoby jsou znovu používány, musí být důkladně vyčištěny a dezinfikovány prostředky s obsahem chlóru). Nejlépe je zpracovat výkrojky z pupkového konce okamžitě. Není-li to možné, uchovávají se v nádobě bez přidání pufru; v chladu nejdéle 72 hodin nebo při pokojové teplotě (18 -25 °C) nejdéle 24 hodin.
Výkrojky z pupkových konců se zpracují jedním z následujících postupů:
nebo
Poznámka:
Při homogenizaci vzorků pomocí mixéru existuje vysoké nebezpečí křížové kontaminace vzorků. Je nutné zamezit vzniku aerosolu nebo rozlití během extrakčního procesu. Pro každý vzorek se použijí čerstvě sterilované nože (ostří) a nádoby. Při testu PCR je nutno zabránit přenosu DNA na nádobách nebo v mlecím přístroji. U testu PCR se doporučuje použít drcení v sáčcích na jedno použití a použití zkumavek na jedno použití.

a) Zalijí se dostatečným množství (přibližně 40 ml) extrakčního pufru (dodatek 4) a třepou se v rotační třepačce (50-100 ot./min) 4 hodiny při teplotě nižší než 24 °C nebo 16-24 hodin chlazené,

b) homogenizují se dostatečným množství (přibližně 40 ml) extrakčního pufru (dodatek 4) buď v mixéru (např. Waring nebo Ultra Thurax) nebo drcením v utěsněném maceračním sáčku na jedno použití (např. silný polyethylenový sáček Stomacher nebo Bioreba, 150mm × 250mm, sterilovaný zářením) pomocí gumového tloučku nebo vhodného mlecího zařízení (např. Homex).

3.1.1.3. Supernatant se dekantuje. Je-li příliš zakalený, pročistí se buď pomalým odstřeďováním (nejvýš 180 g po dobu 10 minut při teplotě 4-10°C) nebo vakuovou filtrací (40-100µm), filtr se omyje přídavkem (10ml) extrakčního pufru.

3.1.1.4. Bakteriální frakce se zahustí odstřeďováním, 7 000g po dobu 15 minut (nebo 10 000g po dobu 10 minut) při teplotě 4-10°C a odstraní se supernatant, aniž by se rozvířila peleta.

3.1.1.5. Peleta se resuspenduje v 1,5 ml peletového pufru (dodatek 4). Použije se 500 µl pro R. solanacearum, 500 µl pro Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus a 500 µl pro referenční účely. Přidá se sterilní glycerol na konečnou koncentraci 10 - 25% (v/v) k 500 µl referenční poměrné části a ke zbývající části vzorku, promíchá se vířením a uloží se při teplotě -16 až -24°C (týdny) nebo -68 až -86°C (měsíce). Extrakty se uchovávají během testování při teplotě 4-10°C.
Opakované zmrazení a rozmrazení se nedoporučuje.
Je-li nutná přeprava extraktu, zajistí se přeprava v chladícím boxu s doručením do 24 až 48 hodin.

3.1.1.6. Je nezbytně nutné, aby všechny pozitivní kontroly a vzorky R. solanacearum byly uchovány a zpracovány odděleně, aby se zabránilo vzájemné kontaminaci. To platí pro sklíčka IF a všechny testy.

3.1.2. Testování
Postupové diagramy a popisy testů a optimalizovaných protokolů jsou v příslušných dodatcích:
Selektivní izolace (viz. oddíl 6.1.4.)
IF test (viz.oddíl 6.1.5.)
Testy PCR (viz. oddíl 6.1.6.)
Test FISH (viz. oddíl 6.1.7.)
Testy ELISA (viz. oddíl 6.1.8.)
Biotest (viz. oddíl 6.1.9.)