6.1.6.1. Metody purifikace DNA
Používají se výše popsané pozitivní a negativní kontrolní vzorky (viz. dodatek 3).
Test kontrolního materiálu se provede týmž způsobem jako test vzorků.
K purifikaci cílové DNA z komplexních substrátů vzorků jsou k dispozici různé metody odstraňující inhibitory PCR a jiných enzymových reakcí a koncentrující cílovou DNA ve vzorku. Následující metoda byla optimalizována pro použití se schválenými metodami PCR uvedenými v dodatku 6.

a) Metoda podle Patrika (2000)

1. Napipetuje se 220 µl lyzátového pufru (100mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8,0)) do 1,5 ml Eppendorfovy mikrozkumavky.

2. Přidá se 100 µl extraktu ze vzorku a mikrozkumavka se umístí do termobloku nebo vodní lázně s teplotou 95 °C na 10 min.

3. Mikrozkumavka se vloží na 5 min. do ledu.

4. Přidá se 80 µl zásobního roztoku lysozymu (50 mg lysozymu/na 1 ml 10 mM TrisHCl, pH 8,0) a inkubuje při teplotě 37 °C po dobu 30 minut.

5. Přidá se 220 µl roztoku Easy DNA® A (Invitrogen), dobře promíchá třepáním a inkubuje se při teplotě 65 °C po dobu 30 minut.

6. Přidá se 100 µl roztoku Easy DNA® B (Invitrogen), důkladně promíchá třepáním, pokud vzorek nezačne být stejnoměrně viskózní.

7. Přidá se 500 µl chloroformu a promíchá, až se viskozita sníží a směs se stane homogenní.

8. Pro oddělení fází a vytvoření mezifáze se směs odstřeďuje při 15 000 g po dobu 20 min. při teplotě 4 °C.

9. Horní fáze se převede do nové Eppendorfovy mikrozkumavky.

10. Přidá se 1 ml 100 % etanolu (- 20 °C), krátce promíchá třepáním a inkubuje se na ledu po dobu 10 min.

11. Odstřeďuje se při 15 000 g po dobu 20 minut při teplotě 4 °C a odstraní se etanol z pelety.

12. Přidá se 500 µl 80 % etanolu (- 20 °C) a promíchá se překlápěním mikrozkumavky.

13. Odstřeďuje se při 15 000 g po dobu 10 minut při teplotě 4 °C, zachová se peleta a odstraní etanol.

14. Peleta se nechá uschnout na vzduchu nebo v DNA odparce.

15. Peleta se resuspenduje v 100 µl sterilní UPW a nechá se stát při pokojové teplotě nejméně 20 minut.

16. Skladuje se při teplotě - 20 °C až do použití při PCR.

17. Jakákoliv bílá sraženina se odstraní odstředěním. 5 µl supernatantu obsahujícího DNA se použije pro test PCR.

b) Jiné metody
Jiné metody extrakce DNA, např. Qiagen DNeasy Plant Kit, by se mohly použít, pokud by se prokázalo, že jsou při purifikaci DNA z kontrolních vzorků obsahujících 10³ až 10⁴ patogenních buněk na 1 ml stejně efektivní.