6.1.6. Testy PCR
Principy
Použije-li se test PCR jako hlavní screeningový test a výsledek je pozitivní, musí být povinně proveden druhý screeningový test, a sice izolace nebo IF. Jestliže je PCR použita jako druhý screeningový test a je pozitivní, je nutné provést další testování podle postupového diagramu, aby byla analýza úplná.
Využití této metody v celém rozsahu jako hlavního screeningového testu se doporučuje jen tehdy, je-li požadována specializovaná expertíza.
Poznámka:
Předběžné testování touto metodou by mělo umožnit reprodukovatelné zjištění 10³ až 10⁴ buněk R. solanacearum na 1 ml přidaný do vzorků extraktů, které byly předtím testovány jako negativní. Dosažení maximální citlivosti a přesnosti ve všech laboratořích může vyžadovat optimalizační pokusy.
Použijí se schválená činidla a protokoly PCR (viz dodatek 6). Pokud možno, zvolí se metoda s interní kontrolou.
Je třeba použít vhodná bezpečnostní opatření k zabránění kontaminace vzorku cílovou DNA. Test PCR by měl být prováděn zkušenými laboranty v laboratořích specializovaných na molekulární biologii, aby se minimalizovala možnost kontaminace cílovou DNA.
S negativními kontrolami (v průběhu extrakce DNA a PCR) by se mělo vždy zacházet jako s konečnými vzorky, aby bylo jasné, jestli došlo k přenosu DNA.
PCR test by měl zahrnovat následující negativní kontroly:
- extraktu ze vzorku, který byl předtím testován na R. solanacearum s negativním výsledkem,
- kontroly pufru používaného pro extrakci bakterií a DNA ze vzorku,
- reakční směs PCR.
Měly by být zahrnuty následující pozitivní kontroly:
- alikvotní části resuspendovaných pelet, do kterých byla přidána R. solanacearum (přípravu viz dodatek 3 B);
- suspenze 10⁶ buněk na 1 ml R. solanacearum ve vodě z virulentního izolátu (např. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; viz dodatek 3 B);
- pokud možno, při PCR použít také DNA extrahovanou z pozitivních kontrolních vzorků.
Aby se zabránilo případné kontaminaci, připravují se pozitivní kontroly v prostředí odděleném od vzorků, které budou testovány.
Extrakty ze vzorků by měly být pokud možno bez zeminy. V případě použití PCR testu je potřeba připravit extrakty z umytých brambor.
Standardizované materiály k pozitivní a negativní kontrole, které lze použít pro tento test, jsou uvedeny v dodatku 3.

6.1.6.1. Metody purifikace DNA
Používají se výše popsané pozitivní a negativní kontrolní vzorky (viz. dodatek 3).
Test kontrolního materiálu se provede týmž způsobem jako test vzorků.
K purifikaci cílové DNA z komplexních substrátů vzorků jsou k dispozici různé metody odstraňující inhibitory PCR a jiných enzymových reakcí a koncentrující cílovou DNA ve vzorku. Následující metoda byla optimalizována pro použití se schválenými metodami PCR uvedenými v dodatku 6.

a) Metoda podle Patrika (2000)

1. Napipetuje se 220 µl lyzátového pufru (100mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8,0)) do 1,5 ml Eppendorfovy mikrozkumavky.

2. Přidá se 100 µl extraktu ze vzorku a mikrozkumavka se umístí do termobloku nebo vodní lázně s teplotou 95 °C na 10 min.

3. Mikrozkumavka se vloží na 5 min. do ledu.

4. Přidá se 80 µl zásobního roztoku lysozymu (50 mg lysozymu/na 1 ml 10 mM TrisHCl, pH 8,0) a inkubuje při teplotě 37 °C po dobu 30 minut.

5. Přidá se 220 µl roztoku Easy DNA® A (Invitrogen), dobře promíchá třepáním a inkubuje se při teplotě 65 °C po dobu 30 minut.

6. Přidá se 100 µl roztoku Easy DNA® B (Invitrogen), důkladně promíchá třepáním, pokud vzorek nezačne být stejnoměrně viskózní.

7. Přidá se 500 µl chloroformu a promíchá, až se viskozita sníží a směs se stane homogenní.

8. Pro oddělení fází a vytvoření mezifáze se směs odstřeďuje při 15 000 g po dobu 20 min. při teplotě 4 °C.

9. Horní fáze se převede do nové Eppendorfovy mikrozkumavky.

10. Přidá se 1 ml 100 % etanolu (- 20 °C), krátce promíchá třepáním a inkubuje se na ledu po dobu 10 min.

11. Odstřeďuje se při 15 000 g po dobu 20 minut při teplotě 4 °C a odstraní se etanol z pelety.

12. Přidá se 500 µl 80 % etanolu (- 20 °C) a promíchá se překlápěním mikrozkumavky.

13. Odstřeďuje se při 15 000 g po dobu 10 minut při teplotě 4 °C, zachová se peleta a odstraní etanol.

14. Peleta se nechá uschnout na vzduchu nebo v DNA odparce.

15. Peleta se resuspenduje v 100 µl sterilní UPW a nechá se stát při pokojové teplotě nejméně 20 minut.

16. Skladuje se při teplotě - 20 °C až do použití při PCR.

17. Jakákoliv bílá sraženina se odstraní odstředěním. 5 µl supernatantu obsahujícího DNA se použije pro test PCR.

b) Jiné metody
Jiné metody extrakce DNA, např. Qiagen DNeasy Plant Kit, by se mohly použít, pokud by se prokázalo, že jsou při purifikaci DNA z kontrolních vzorků obsahujících 10³ až 10⁴ patogenních buněk na 1 ml stejně efektivní.

6.1.6.2. PCR

1. Připraví se testované vzorky a kontroly pro PCR podle schválených protokolů (6.1.6). Připraví se desetinásobné ředění vzorku extraktu DNA (1:10 ve sterilní vodě).

2. Připraví se příslušná reakční směs pro PCR v prostředí, ve kterém nehrozí kontaminace podle zveřejněných protokolů (dodatek 6). Pokud možno, doporučuje se použít multiplexní protokol PCR, který rovněž zahrnuje interní protokol PCR.

3. Do sterilních PCR mikrozkumavek se přidá 5 µl extraktu DNA na 25 µl PCR reakce podle protokolů PCR (viz dodatek 6).

4. Přidají se negativní kontrolní vzorky obsahující pouze reakční směs PCR a přidá se týž zdroj UPW jako byl ten, který byl použit ve směsi PCR místo vzorku.

5. PCR mikrozkumavky se umístí do téhož termocykleru, který byl použit při počátečním testování, a spustí se vhodně optimalizovaný program PCR (dodatek 6).

6.1.6.3. Analýza produktu PCR
Interpretace výsledků testu PCR
Test PCR je negativní, jestliže amplikon PCR specifický pro R. solanacearum očekávané velikosti není u zkoumaného vzorku zjištěn, ale je zjištěn u všech pozitivních kontrolních vzorků (v případě vícenásobné PCR s interními kontrolními primery specifickými pro rostlinu: druhý produkt PCR očekávané velikosti musí být amplifikován se zkoumaným vzorkem).
Test PCR je pozitivní, jestliže je zjištěn amplikon PCR specifický pro R. solanacearum očekávané velikosti a (případně) vzoru, za předpokladu, že není amplifikován u žádného vzorku negativní kontroly. Spolehlivé potvrzení pozitivního výsledku lze také získat opakováním testu s druhou sadou primerů PCR dodatek 6).
Poznámka:
Lze mít podezření na inhibici PCR, jestliže je získán očekávaný amplikon ze vzorku pozitivní kontroly obsahujícího R. solanacearum ve vodě, zatímco ze vzorku pozitivní kontroly R. solanacearum v bramborovém extraktu byly získány negativní výsledky. V multiplexních protokolech PCR s interními kontrolami PCR nasvědčuje inhibici reakce, jestliže není získán žádný ze dvou amplikonů.
V případě, že očekávaný amplikon je získán z jednoho nebo více vzorků negativních kontrol, je podezření na kontaminaci.

1. Amplikony se rozdělí elektroforézou v agarózovém gelu. Nanese se nejméně 12 µl směsi amplifikované DNA z každého vzorku s 3 µl nanášecího pufru (dodatek 6) do 2,0 % (w/v) agarózového gelu v Tris-acetát-EDTA (TAE) pufru (dodatek 6) při 5-8 V/cm. Použije se vhodný DNA marker, např. (ladder) 100 bp.

2. Detekují se proužky DNA obarvením v ethidiumbromidu (0,5 mg/l) po dobu 30-60 minut za použití vhodných bezpečnostních opatření pro zacházení s tímto mutagenem.

3. V obarveném a UV (krátké vlnové délky např. 302 nm) prosvíceném gelu se hledají amplifikované produkty PCR o očekávané velikosti a výsledek se zdokumentuje.

4. U všech nových nálezů/případů se zkontroluje pravost amplikonu PCR provedením restrikční enzymové analýzy ve zbývajícím vzorku amplifikované DNA inkubací při optimální teplotě a čase shodným restrikčním enzymem a pufrem (viz dodatek 6). Naštěpené fragmenty se rozdělí elektroforézou v agarózovém gelu a pozoruje se charakteristický vzor restrikčních fragmentů pod UV světlem po obarvení ethidiumbromidem a porovnává se s neštěpenou a štěpenou pozitivní kontrolou.