6.1.6.3. Analýza produktu PCR
Interpretace výsledků testu PCR
Test PCR je negativní, jestliže amplikon PCR specifický pro R. solanacearum očekávané velikosti není u zkoumaného vzorku zjištěn, ale je zjištěn u všech pozitivních kontrolních vzorků (v případě vícenásobné PCR s interními kontrolními primery specifickými pro rostlinu: druhý produkt PCR očekávané velikosti musí být amplifikován se zkoumaným vzorkem).
Test PCR je pozitivní, jestliže je zjištěn amplikon PCR specifický pro R. solanacearum očekávané velikosti a (případně) vzoru, za předpokladu, že není amplifikován u žádného vzorku negativní kontroly. Spolehlivé potvrzení pozitivního výsledku lze také získat opakováním testu s druhou sadou primerů PCR dodatek 6).
Poznámka:
Lze mít podezření na inhibici PCR, jestliže je získán očekávaný amplikon ze vzorku pozitivní kontroly obsahujícího R. solanacearum ve vodě, zatímco ze vzorku pozitivní kontroly R. solanacearum v bramborovém extraktu byly získány negativní výsledky. V multiplexních protokolech PCR s interními kontrolami PCR nasvědčuje inhibici reakce, jestliže není získán žádný ze dvou amplikonů.
V případě, že očekávaný amplikon je získán z jednoho nebo více vzorků negativních kontrol, je podezření na kontaminaci.

1. Amplikony se rozdělí elektroforézou v agarózovém gelu. Nanese se nejméně 12 µl směsi amplifikované DNA z každého vzorku s 3 µl nanášecího pufru (dodatek 6) do 2,0 % (w/v) agarózového gelu v Tris-acetát-EDTA (TAE) pufru (dodatek 6) při 5-8 V/cm. Použije se vhodný DNA marker, např. (ladder) 100 bp.

2. Detekují se proužky DNA obarvením v ethidiumbromidu (0,5 mg/l) po dobu 30-60 minut za použití vhodných bezpečnostních opatření pro zacházení s tímto mutagenem.

3. V obarveném a UV (krátké vlnové délky např. 302 nm) prosvíceném gelu se hledají amplifikované produkty PCR o očekávané velikosti a výsledek se zdokumentuje.

4. U všech nových nálezů/případů se zkontroluje pravost amplikonu PCR provedením restrikční enzymové analýzy ve zbývajícím vzorku amplifikované DNA inkubací při optimální teplotě a čase shodným restrikčním enzymem a pufrem (viz dodatek 6). Naštěpené fragmenty se rozdělí elektroforézou v agarózovém gelu a pozoruje se charakteristický vzor restrikčních fragmentů pod UV světlem po obarvení ethidiumbromidem a porovnává se s neštěpenou a štěpenou pozitivní kontrolou.