6.1.7.1. Fixace bramborového extraktu
Následující protokol vychází z Wullingse et al. (1998).
1 Připraví se fixační roztok (viz dodatek 7).
2. Napipetuje se 100 µl každého vzorkového extraktu do Eppendorfovy mikrozkumavky a odstřeďuje se po dobu 7 minut na 7 000 g.
3. Odstraní se supernatant a rozpustí se peleta ve 200 µl fixačního roztoku připraveného max. 24 hodin předem. Protřepe se a inkubuje 1 hodinu v chladícím zařízení.
4. Odstřeďuje se 7 minut při 7 000 g, odstraní se supernatant a resuspenduje se peleta v 75 µl 0,01M PB (viz dodatek 7).
5. Kápne se 16 µl fixované suspenze na čisté 10 okénkové sklíčko, jak ukazuje obrázek 7.1, přičemž se použijí 2 různé vzorky na jedno sklíčko, a to neředěný a zředěný 1:100 s použitím 10 µl (v 0,01 M PB). Zbývající roztok vzorku (49 µl) může být uložen při teplotě - 20 °C po přidání 1 objemového množství 96 % etanolu. V případě, že je třeba FISH metodu opakovat, odstraní se etanol odstředěním a přidá se stejné množství 0,01 PB (zamíchá se protřepáním).
Obrázek 7.1 Rozmístění na sklíčku FISH
6. Sklíčka se nechají uschnout na vzduchu (nebo v sušičce sklíček při teplotě 37 °C) a fixují se nad plamenem.
V této fázi je možné postup přerušit a pokračovat v hybridizaci další den. Sklíčka by měla být skladována chráněna před prachem a v suchu při pokojové teplotě.