6.1.7. Test FISH
Princip
Když se jako první screeningový test použije FISH test a je pozitivní, musí být jako druhý povinný screeningový test provedena izolace nebo IF test. Když se FISH test provede jako druhý vyšetřovací test a je pozitivní, je k dokončení diagnózy nutné další testování podle postupového diagramu.
Poznámka:
Používají se schválené oligosondy specifické pro R. solanacearum (dodatek 7). Úvodní testování touto metodou by mělo umožnit reprodukovatelné zjištění alespoň 10³-10⁴ buněk R. solanacearum na ml přidané do extraktů ze vzorku, které byly předtím testovány s negativním výsledkem.
Následující postup by měl být pokud možno proveden s čerstvě připravenými extrakty, ale je možné jej úspěšně provést s extraktem, který byl uchován v glycerolu při teplotě - 16 až - 24 °C nebo - 68 až - 86 °C.
Jako negativní kontrola se použije alikvotní část extraktu ze vzorku, který byl předtím testován na R. solanacearum s negativním výsledkem.
Jako pozitivní kontrola se připraví suspenze obsahující 10⁵ až 10⁶ buněk na 1 ml R. solanacearum biovar 2 (např. kmen NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, viz dodatek 3) v 0,01M fosfátovém pufru (PB) ze 3-5 denní kultury. Připraví se samostatná sklíčka s pozitivními kontrolními vzorky homologického kmenu nebo jiného referenčního kmene R. solanacearum, suspendovaného v bramborovém extraktu, jak je uvedeno v dodatku 3 B.
Použití eubakteriálních oligosond značených FITC poskytuje kontrolu procesu hybridizace, protože zbarví všechny eubakterie přítomné ve vzorku.
Standardizovaný pozitivní a negativní kontrolní materiál, který se používá v tomto testu, je uveden v dodatku 3 bodu A.
Test kontrolního materiálu se provede stejným způsobem jako u vzorku(ů).

6.1.7.1. Fixace bramborového extraktu
Následující protokol vychází z Wullingse et al. (1998).

1 Připraví se fixační roztok (viz dodatek 7).

2. Napipetuje se 100 µl každého vzorkového extraktu do Eppendorfovy mikrozkumavky a odstřeďuje se po dobu 7 minut na 7 000 g.

3. Odstraní se supernatant a rozpustí se peleta ve 200 µl fixačního roztoku připraveného max. 24 hodin předem. Protřepe se a inkubuje 1 hodinu v chladícím zařízení.

4. Odstřeďuje se 7 minut při 7 000 g, odstraní se supernatant a resuspenduje se peleta v 75 µl 0,01M PB (viz dodatek 7).

5. Kápne se 16 µl fixované suspenze na čisté 10 okénkové sklíčko, jak ukazuje obrázek 7.1, přičemž se použijí 2 různé vzorky na jedno sklíčko, a to neředěný a zředěný 1:100 s použitím 10 µl (v 0,01 M PB). Zbývající roztok vzorku (49 µl) může být uložen při teplotě - 20 °C po přidání 1 objemového množství 96 % etanolu. V případě, že je třeba FISH metodu opakovat, odstraní se etanol odstředěním a přidá se stejné množství 0,01 PB (zamíchá se protřepáním).
Obrázek 7.1 Rozmístění na sklíčku FISH

6. Sklíčka se nechají uschnout na vzduchu (nebo v sušičce sklíček při teplotě 37 °C) a fixují se nad plamenem.
V této fázi je možné postup přerušit a pokračovat v hybridizaci další den. Sklíčka by měla být skladována chráněna před prachem a v suchu při pokojové teplotě.

6.1.7.2. Hybridizace

1. Dehydratují se buňky v postupné etanolové řadě 50 %, 80 % a 96 %, pokaždé po dobu 1 minuty. Osuší se vzduchem v držáku sklíček.

2. Připraví se vlhká inkubační komora přikrytím dna vzduchotěsného boxu tkaninou nebo filtračním papírem nasáklým hybridizační směsí (1x hybmix, dodatek 7). Před inkubací se ohřeje box v hybridizační peci při teplotě 45 °C po dobu nejméně 10 minut.

3. Použije se 10 µl hybridizačního roztoku (dodatek 7) na 8 okének (okénka 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 a 10; viz obr.7.1) na každém sklíčku, přičemž dvě středová okénka (3 a 8)se nechají prázdná.

4. Přiloží se krycí sklíčka (24 x 24 mm) na první a poslední 4 okénka, a to tak, aby pod ně nevnikl vzduch. Sklíčka se umístí do předem zahřáté vlhké komory a nechá se proběhnout proces hybridizace po dobu 5 hodin v troubě při teplotě 45 °C v temnu.

5. Připraví se 3 kádinky obsahující 1 l vody s molekulární kvalitou (Milli Q), 1 l 1x hybmix (334 ml 3x hybmix a 666 ml vody s molekulární kvalitou) a 1 l 1/8x hybmixu (42 ml 3x hybmix a 958 ml vody s molekulární kvalitou). Nechají se inkubovat ve vodní lázni o teplotě 45 °C.

6. Sejmou se krycí sklíčka a podložní sklíčka se umístí do držáku sklíček.

7. Spláchne se nadbytek vzorku inkubací po dobu 15 minut v kádince s 1 x hybmixem při teplotě 45°C.

8. Držák sklíček se přemístí do promývacího roztoku 1/8 hybmix a nechá se inkubovat dalších 15 minut.

9. Sklíčka se krátce ponoří do UPW (např. Milli Q water) a položí na filtrační papír. Odstraní se nadbytečná vlhkost lehkým zakrytím povrchu filtračním papírem. Napipetuje se 5-10 µl krycího roztoku (např. Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA nebo podobný) do každého okénka a celé sklíčko se zakryje velkým krycím sklíčkem (24 x 60 mm).

6.1.7.3. Hodnocení FISH testu

1. Sklíčka se ihned prohlížejí pod mikroskopem vhodným pro epifluorescenční mikroskopii se zvětšením 630 x nebo 1 000 x pod olejovou imerzí. S filtrem vhodným pro fluorescein isothiokyanat (FITC) jsou eubakteriální buňky(včetně většiny gramnegativních buněk) ve vzorku zbarveny fluorescenčně zeleně. Použitím filtru pro tetramethylrhodamin-5-isothiokyanat se buňky R. solanacearum obarvené Cy3 jeví fluorescenčně červené. Porovnává se buněčná morfologie s morfologií pozitivních kontrolních vzorků. Buňky musí být jasně fluoreskující a zcela zbarveny. Test FISH (odst. 6.1.7) musí být zopakován, pokud je zbarvení odchylné. Prohlížejí se okénka napříč dvěma průměry v pravých úhlech a kolem obvodu. U vzorků, kde nejsou pozorovány žádné nebo málo buněk, se pozoruje nejméně 40 polí mikroskopu.

2. Hledají se jasně fluoreskující buňky s morfologií charakteristickou pro R. solanacearum v okénkách testovacích sklíček. Intenzita fluorescence musí odpovídat nebo být lepší než u pozitivního kontrolního kmene. Buňky, které nejsou zcela zbarveny nebo vykazují slabou fluorescenci, se neberou v úvahu.

3. Při podezření na jakoukoli kontaminaci musí být test opakován. To může nastat v případě, kdy všechna sklíčka ve várce ukazují pozitivní buňky z důvodu kontaminace pufru nebo jestliže jsou pozitivní buňky zjištěny (vně okénka sklíčka) na krytu sklíčka.

4. Specifičnost testu FISH s sebou nese několik problémů. Je pravděpodobné, že u pletiv z bramborových hlíz a pelet ze stonkových partií bramboru dojde k výskytu populací fluorescenčních buněk na pozadí s atypickou morfologií a ke křížové reakci se saprofytickými bakteriemi velikostí a morfologií podobnými R. solanacearum, i když mnohem méně častěji než u testu IF.

5. V úvahu se berou pouze fluoreskující buňky s typickou velikostí a morfologií.

6. Interpretace výsledků testu FISH
i) Výsledky FISH testu jsou platné, pokud jsou při použití FITC filtru jasně zeleně fluoreskující buňky s velikostí a morfologií typickou pro R. solanacearum a při použití rhodaminového filtru jasně červeně fluoreskující buňky pozorovány ve všech pozitivních kontrolách a nejsou pozorovány v žádných negativních kontrolách. Pokud jsou přítomné jasně fluoreskující buňky s typickou morfologií, odhadne se průměrný počet typických buněk v 1 mikroskopovém poli a vypočítá počet typických buněk v 1 ml resuspendované pelety (dodatek 4). Vzorky, které obsahují alespoň 5 x 10³ typických buněk na 1 ml resuspendované pelety, se považují za pravděpodobně infikované. Nutné je další testování. Vzorky, které obsahují méně než 5 x 10³ typických buněk na 1 ml resuspendované pelety, se považují za negativní.
ii) Výsledek FISH testu je negativní, pokud při použití rhodaminového filtru nejsou pozorovány jasně červeně fluoreskující buňky s velikostí a morfologií typickou pro R. solanacearum, jestliže jsou tyto typické jasně červeně fluoreskující buňky při použití rhodaminového filtru pozorovány v pozitivních kontrolách.