Dodatek 4
Pufry pro testovací postupy
OBECNĚ: Neotevřené sterilizované pufry lze skladovat po dobu až jednoho roku.
1. Pufry pro extrakci
1.1 Extrakční pufr (50 mM fosfátový pufr, pH 7,0)
Tento pufr se používá k extrakci bakterie z rostlinných tkání homogenizací nebo protřepáním.
| Na2 HPO4 (bezvodý) | 4,26 g |
| KH2PO4 | 2,72 g |
| Destilovaná voda | 1,00 l |
Rozpustí se složky, zkontroluje pH a sterilizuje v autoklávu při 121 °C po dobu 15 min.
Užitečné mohou být následující složky:
| Účel | Množství (na litr) | |
|---|---|---|
| Lubrolové vločky | Protisrážlivý prostředek (*) | 0,5 g |
| DC silikonový odpěňovač | Odpěňovací činidlo (*) | 1,0 ml |
| Tetrasodiumpyrofosfát | Antioxidační činidlo | 1,0 g |
| Polyvinylpyrrolidon-40 000 (PVP – 40) | Vázání inhibitorů PCR | 50 g |
| (*) pro použití při extrakci homogenizací | ||
1.2. Peletový pufr (10 mM fosfátový pufr, pH 7,2)
Tento pufr se používá pro resuspenzi a ředění extraktů z výkrojků z pupkových částí bramborových hlíz poté, co byly odstřeďováním koncentrovány do pelety.
| Na2HPO4.12H2O | 2,7 g |
| NaH2PO4. 2H2O | 0,4 g |
| Destilovaná voda | 1,00 l |
Rozpustí se složky, zkontroluje pH a sterilizuje v autoklávu při 121 °C po dobu 15 min.
2. Pufry pro IF test
Pufr pro IF (10 mM fosfátový pufr ve fyziologickém roztoku (PBS), pH 7,2)
Tento pufr se používá k ředění protilátek.
| Na2HPO4.12H2O | 2,7 g |
| NaH2PO4 . 2H2O | 0,4 g |
| NaCl | 8,0 g |
| Destilovaná voda | 1,00 l |
Rozpustí se složky, zkontroluje pH a sterilizuje v autoklávu při 121 °C po dobu 15 min.
IF-pufr-Tween
Tento pufr se používá k oplachování podložních sklíček.
Přidá se 0,1 % Tween 20 k pufru pro IF.
Fosfátový pufr v glycerolu, pH 7,6
Tento pufr se používá jako krycí roztok na okénka sklíček na IF testy k zvýšení fluorescence.
| Na2HPO4 .12H2O | 3,2 g |
| NaH2PO4 . 2H2O | 0.15 g |
| Glycerol | 50 ml |
| Destilovaná voda | 100 ml |
Krycí roztoky jsou komerčně dostupné, např. Vectashield® (Vector Laboratories) nebo Citifluor® (Leica).
3. Pufry pro účely nepřímého testu ELISA
3.1. Dvojnásobný uhličitanový potahovací pufr, pH 9,6.
| Na2CO3 | 6,36 g |
| NaH CO3 | 11,72 g |
| Destilovaná voda | 1,00 l |
Rozpustí se složky, zkontroluje pH a steriluje autoklávováním při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.
Pokud extrakt obsahuje vysoký podíl aromatických molekul, je možné jako antioxidant přidat siřičitan sodný (0,2 %).
3.2. Desetinásobný roztok chloridu sodného pufrovaný fosfátem (10 x PBS), pH 7,4
| NaCl | 80,0 g |
| KH2PO4 | 2,0 g |
| Na2HPO4 . 12H2O | 29,0 g |
| KCl | 2,0 g |
| Destilovaná voda | 1,00 l |
3.3. PBS-Tween
| 10 x PBS | 100 ml |
| 10 % Tween 20 | 5 ml |
| Destilovaná voda | 895 ml |
3.4. Blokační pufr (musí být čerstvě připraven).
| 10 x PBS | 10,0 ml |
| Polyvinylpyrrolidon-44000 (PVP-44) | 2,0 g |
| 10 % Tween 20 | 0,5 ml |
| Sušené mléko | 0,5 g |
| Destilovaná voda | doplnit do 100 ml |
3.5. Roztok pro substrát alkalické fosfatázy, pH 9,8
| Diethanolamin | 97 ml |
| Destilovaná voda | 800 ml |
Rozpustí se a koncentrovanou HCl se upraví pH na 9,8.
Doplní se do 1 l destilovanou vodou.
Přidá se 0,2 g MgCl2.
Rozpustí se dvě 5 mg tabletky fosfatázového substrátu (Sigma) v 15 ml roztoku.
4. Pufry pro účely testu DASI ELISA
4.1. Potahovací pufr, pH 9,6.
| Na2CO3 | 1,59 g |
| NaH CO3 | 2,93 g |
| Destilovaná voda | 1 000 ml |
Rozpustí se složky a zkontroluje pH 9,6.
4.2. 10 x fosfátosolný pufr (PBS) pH 7,2‒ 7,4
| NaCl | 80,0 g |
| Na2HPO4.12H2O | 27 g |
| NaH2PO4 . 2H2O | 4g |
| Destilovaná voda | 1 000 ml |
4.3. PBS-Tween
| 10 x PBS | 50 ml |
| 10 % Tween 20 | 5 ml |
| Destilovaná voda | 950 ml |
4.4 Substrátový pufr, pH 9,8
| Diethanolamin | 100 ml |
| Destilovaná voda | 900 ml |
Smíchá se a nastaví se hodnota pH 9,8 koncentrovanou HCl.