1. Protokol PCR Seal et al. (1993)
1.1. Oligonukleotidové primery
Přímý primer OLI-1: 5'-GGG GGT AGC TTG CTA CCT GCC-3'
Reverzní primer Y-2: 5'-CCC ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3'
Očekávaná velikost amplikonu templátové DNA R. solanacearum = 288 bp
1.2. Reakční směs PCR
| Reagencie | Množství v reakci | Konečná koncentrace |
|---|---|---|
| Sterilní UPW | 17,65 µl | |
| 10× pufr PCR (1) (15 mM MgCl2) | 2,5 µl | 1x (1,5mM MgCl2) |
| Směs dNTP (20mM) | 0,25 µl | 0,2 mM |
| Primer OLI-1 (20 µM) | 1,25 µl | 1µM |
| Primer Y-2 (20 µM) | 1,25 µl | 1µM |
| Taq polymerasa (5U/µl) (1) | 0,1 µl | 0,5 U |
| Množství vzorku | 2,0 µl | |
| Celkové množství | 25 µl | |
| (1) Metoda byla validována použitím Taq polymerázy Perkin Elmer (AmpliTaq) a Gibco BRL. | ||
1.3. Reakční podmínky PCR
Provede se následující cyklický proces:
| 1 cyklus: | i) 2 minuty při 96 °C (denaturace templátové DNA) |
| 35 cyklů: | ii) 20 sekund při 94 °C (denaturace templátové DNA) |
| iii) 20 sekund při 68 °C (hybridizace primerů s templátovou DNA) | |
| iv) 30 sekund při 72 °C (syntéza kopie) | |
| 1 cyklus: | v) 10 minut při 72 °C (závěrečná syntéza) |
| vi) ponechá se při teplotě 4 °C. |
Poznámka:
Tento program byl optimalizován pro použití termocykleru Perkin Elmer 9600. Použití jiných přístrojů může vyžadovat úpravu jednotlivých kroků cyklu ii), iii) a iv).
1.4. Restrikční enzymová analýza amplikonu.
Produkty PCR vzniklé amplifikací z R. solanacearum DNA vytvářejí polymorfismus délky restrikčních fragmentů s enzymem Ava II po inkubaci při teplotě 37 °C.