Dodatek 6
Validované protokoly a činidla pro PCR
Poznámka:
Úvodní testování by mělo umožnit reprodukovatelné zjištění nejméně 103 až 104 buněk R. solanacearum na 1 ml vzorkového extraktu. Úvodní testování by také nemělo vykazovat žádné falešné pozitivní výsledky se skupinou vybraných kmenů bakterií (viz dodatek 3).
1. Protokol PCR Seal et al. (1993)
1.1. Oligonukleotidové primery
Přímý primer OLI-1: 5'-GGG GGT AGC TTG CTA CCT GCC-3'
Reverzní primer Y-2: 5'-CCC ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3'
Očekávaná velikost amplikonu templátové DNA R. solanacearum = 288 bp
1.2. Reakční směs PCR
| Reagencie | Množství v reakci | Konečná koncentrace |
|---|---|---|
| Sterilní UPW | 17,65 µl | |
| 10× pufr PCR (1) (15 mM MgCl2) | 2,5 µl | 1x (1,5mM MgCl2) |
| Směs dNTP (20mM) | 0,25 µl | 0,2 mM |
| Primer OLI-1 (20 µM) | 1,25 µl | 1µM |
| Primer Y-2 (20 µM) | 1,25 µl | 1µM |
| Taq polymerasa (5U/µl) (1) | 0,1 µl | 0,5 U |
| Množství vzorku | 2,0 µl | |
| Celkové množství | 25 µl | |
| (1) Metoda byla validována použitím Taq polymerázy Perkin Elmer (AmpliTaq) a Gibco BRL. | ||
1.3. Reakční podmínky PCR
Provede se následující cyklický proces:
| 1 cyklus: | i) 2 minuty při 96 °C (denaturace templátové DNA) |
| 35 cyklů: | ii) 20 sekund při 94 °C (denaturace templátové DNA) |
| iii) 20 sekund při 68 °C (hybridizace primerů s templátovou DNA) | |
| iv) 30 sekund při 72 °C (syntéza kopie) | |
| 1 cyklus: | v) 10 minut při 72 °C (závěrečná syntéza) |
| vi) ponechá se při teplotě 4 °C. |
Poznámka:
Tento program byl optimalizován pro použití termocykleru Perkin Elmer 9600. Použití jiných přístrojů může vyžadovat úpravu jednotlivých kroků cyklu ii), iii) a iv).
1.4. Restrikční enzymová analýza amplikonu.
Produkty PCR vzniklé amplifikací z R. solanacearum DNA vytvářejí polymorfismus délky restrikčních fragmentů s enzymem Ava II po inkubaci při teplotě 37 °C.
2. Protokol PCR Pastrika a Maisse (2000)
2.1. Oligonukleotidové primery
Přímý primer Ps-1: 5'-agt cga acg gca gcg ggg g -3'
Reverzní primer Ps-2: 5'-ggg gat ttc aca tcg gtc ttg ca -3
Očekávaná velikost amplikonu templátové DNA R. solanacearum DNA = 553 bp.
2.2. Reakční směs PCR
| Reagencie | Množství v reakci | Konečná koncentrace |
|---|---|---|
| Sterilní UPW | 16,025 µl | |
| 10x pufr PCR (1) | 2,5 µl | 1x (1,5 mM MgCl2) |
| BSA (frakce V) (10 %) | 0,25 µl | 0,1 % |
| Směs dNTP (20mM) | 0,125 µl | 0,1 mM |
| Primer Ps-1 (10 µM) | 0,5 µl | 0,2 µM |
| Primer Ps-2 (10 µM) | 0,5 µl | 0,2 µM |
| Taq polymerasa (5U/µl) (1) | 0,1 µl | 0,5 U |
| Množství vzorku | 5,0 µl | |
| Celkové množství | 25,0 µl | |
| (1) Metoda byla validována použitím Taq polymerázy Perkin Elmer (AmpliTaq) a Gibco BRL. Poznámka: Původně optimalizovaná pro termocykler MJ Research PTC 200 s polymerasou Gibco Taq Polymerace. Perkin Elmer AmpliTaq a pufr mohou být rovněž použity ve stejných koncentracích. | ||
2.3 Reakční podmínky PCR
Provede se následující cyklický proces:
| 1 cyklus | i) 5 minut při 95 °C (denaturace templátové DNA) |
| 35 cyklů: | ii) 30 sekund při 95 °C (denaturace templátové DNA) |
| iii) 30 sekund při 68 °C (hybridizace primerů s templátovou DNA) | |
| iv) 45 sekund při 72 °C (syntéza kopie) | |
| 1 cyklus: | v) 5 minut při 72 °C (syntéza extenze) |
| vi) ponechá se při teplotě 4 °C. |
Poznámka:
Tento program byl optimalizován pro použití termocykleru MJ Research PTC 200. Použití jiných přístrojů bude možná vyžadovat úpravu jednotlivých kroků cyklu ii), iii) a iv).
2.4. Restrikční enzymová analýza amplikonu
Produkty PCR vzniklé amplifikací z R. solanacearum DNA vytvářejí zřetelný polymorfismus délky restrikčních fragmentů s enzymem Taq I po inkubační době 30 minut při teplotě 65 °C. Restrikční fragmenty specifické pro R. solanacearum mají velikost 457 bp a 96 bp.
3. Protokol pro multiplexní PCR s interní kontrolou (Pastrik et al., 2002)
3.1. Oligonukleotidové primery
Přímý primer RS-1-F: 5'-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3'
Reverzní primer RS-1-R: 5'-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3'
Přímý primer NS-5-F: 5'-AAC TTA AAG GAA TTG ACG GAA G-3'
Reverzní primerNS-6-R: 5'-GCA TCA CAG ACC TGT TAT TGC CTC-3'
Očekávaná velikost amplikonu templátové DNA R. solanacearum = 718 bp (sada primerů RS).
Očekávaná velikost amplikonu interní kontroly PCR 18S rRNA = 310 bp (sada primerů NS).
3.2. Reakční směs PCR
| Reagencie | Množství v reakci | Konečná koncentrace |
|---|---|---|
| Sterilní UPW | 12,625 µl | |
| 10x pufr PCR (1) (15 mM MgCl2) | 2,5 µl | 1x (1,5 mM MgCl2) |
| BSA (frakce V) (10 %) | 0,25 µl | 0,1 % |
| Směs dNTP (20mM) | 0,125 µl | 0,1 mM |
| Primer RS-1-F (10 µM) | 2,0 µl | 0,8 µM |
| Primer RS-1-R (10 µM) | 2,0 µl | 0,8 µM |
| Primer NS-S-F (10 µM)(2) | 0,15 µl | 0,06 µM |
| Primer NS-6-R (10 µM)(2) | 0,15 µl | 0,06 µM |
| Taq polymeráza (5U/µl)(1) | 0,2 µl | 1,0 U |
| Množství vzorku | 5,0 µl | |
| Celkové množství | 25,0 µl | |
| (1) Metoda byla validována použitím Taq polymerázy Perkin Elmer (AmpliTaq) a Gibco BRL. (2) Koncentrace primerů NS-5-F a NS-6-R byly optimalizovány pro výkrojky pletiva pupkových částí hlíz bramboru pomocí homogenizační metody a purifikace DNA podle Pastrika (2000) (viz 6.1.6.1.a)). Použití extrakční metody třepáním nebo jiných metod izolace DNA může vyžadovat nové provedení optimalizace koncentrací reagencií. | ||
3.3. Reakční podmínky PCR
Provede se následující cyklický proces:
| 1 cyklus: | i) 5 minut při 95 °C (denaturace templátové DNA) |
| 35 cyklů: | ii) 30 sekund při 95 °C (denaturace templátové DNA) |
| iii) 30 sekund při 58 °C (hybridizace primerů s templátovou DNA) | |
| iv) 45 sekund při 72 °C (syntéza kopie) | |
| 1 cyklus: | v) 5 minut při 72 °C (konečná syntéza) |
| vi) nechá se při teplotě 4 °C. |
Poznámka:
Tento program byl optimalizován pro použití termocykleru MJ Research PTC 200. Použití jiných přístrojů může vyžadovat úpravu jednotlivých kroků cyklu ii), iii) a iv).
3.4. Restrikční enzymová analýzy amplikonu
Produkty PCR vzniklé amplifikací z DNA R. solanacearum vytvářejí zřetelný polymorfismus délky restrikčních fragmentů s enzymem Bsm I nebo Isoschizomere (např. Mva 1269 I) po inkubační době 30 minut při teplotě 65 °C.
4. Protokol PCR specifický pro biovar R. solanacearum (Pastrik et al, 2001)
4.1. Oligonukleotidové primery
Přímý primer Rs-1-F: 5'-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3'
Reverzní primer Rs-1-R: 5'-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3'
Reverzní primer Rs-3-R: 5'-TTC ACG GCA AGA TCG CTC-3'
Očekávaná velikost amplikonu templátové DNA R. solanacearum:
s Rs-1-F/Rs-1-R = 718 bp
s Rs-1-F/Rs-3-R = 716 bp
4.2. Reakční směs PCR
a) Protokol PCR specifický pro biovar 1/2
| Reagencie | Množství v reakci | Konečná koncentrace |
|---|---|---|
| Sterilní UPW | 12,925 µl | |
| 10x pufr PCR(1) | 2,5 µl | 1x (1,5 mM MgCl2) |
| BSA (frakce V) (10 %) | 0,25 µl | 0,1 % |
| Směs dNTP (20mM) | 0,125 µl | 0,1 mM |
| Primer Rs-1-F (10 µM) | 2,0 µl | 0,8 µM |
| Primer Rs-1-R (10 µM) | 2,0 µl | 0,8 µM |
| Taq polymeráza (5U/µl)(1) | 0,2 µl | 1,0 U |
| Množství vzorku | 5,0 µl | |
| Celkové množství | 25,0 µl | |
| (1) Metoda byla validována použitím Taq polymerázy Perkin Elmer (AmpliTaq) a Gibco BRL. | ||
b) Protokol PCR specifický pro Biovar 3/4/5
| Reagencie | Množství v reakci | Konečná koncentrace |
|---|---|---|
| Sterilní UPW | 14,925 µl | |
| 10x pufr PCR (1) | 2,5 µl | 1x (1,5 mM MgCl2) |
| BSA (frakce V) (10 %) | 0,25 µl | 0,1 % |
| Směs dNTP (20mM) | 0,125 µl | 0,1 mM |
| Primer Rs-1-F (10 µM) | 1,0 µl | 0,4 µM |
| Primer Rs-3-R (10 µM) | 1,0 µl | 0,4 µM |
| Taq polymeráza (5U/µl) (1) | 0,2 µl | 1,0 U |
| Množství vzorku | 5,0 µl | |
| Celkové množství | 25,0 µl | |
| (1)Metoda byla validována použitím Taq polymerázy Perkin Elmer (AmpliTaq) a Gibco BRL. | ||
4.3. Reakční podmínky PCR
Provede se následující cyklický proces pro obě reakce specifické pro biovary 1/2- a biovary 3/4/5:
| 1 cyklus: | i) 5 minut při 95 °C (denaturace templátové DNA) |
| 35 cyklů: | ii) 30 sekund při 95 °C (denaturace templátové DNA) |
| iii) 30 sekund při 58 °C (hybridizace primerů s templátovou DNA) | |
| iv) 45 sekund při 72 °C (syntéza kopie) | |
| 1 cyklus: | v) 5 minut při 72 °C (konečná syntéza) |
| vi) ponechá se při teplotě 4 °C. |
Poznámka:
Tento program byl optimalizován pro použití termocykleru MJ Research PTC 200. Použití jiných přístrojů může vyžadovat úpravu jednotlivých kroků cyklu ii), iii) a iv).
4.4. Restrikční enzymová analýza amplikonu.
Produkty PCR vzniklé amplifikací DNA R. solanacearum pomocí primerů Rs-1-F a Rs-1-R vytvářejí zřetelný polymorfismus délky restrikčních fragmentů s enzymem Bsm I nebo Isoschizomere (např. Mva 1269 I) po inkubační době 30 minut při teplotě 65 °C. Produkty PCR vzniklé amplifikací z DNA R. solanacearum pomocí primerů Rs-1-F a Rs-3-R nemají žádná restrikční místa.
5. Příprava nanášecího pufru
5.1. Bromfenolová modř (10 % zásobní roztok)
| Bromfenolová modř | 5g |
| Destilovaná (redestilovaná) voda | 50 ml |
5.2. Nanášecí pufr
| Glycerol (86 %) | 3,5 ml |
| Bromfenolová modř (5,1) | 300 µl |
| Destilovaná (redestilovaná) voda (bidestilát) | 6,2 ml |
6. Pufr 10x TRIS-acetát-EDTA (TAE), pH 8,0
| TRIS | 48,4 g |
| Ledová kyselina octová | 11,42 ml |
| EDTA (sodná sůl) | 3,72 g |
| Destilovaná voda | 1,00 l |
Před použitím se zředí na 1X.
Také komerčně dostupné (např. Invitrogen nebo rovnocenné).