bod 4 · 331/2004 Sb.

4. Protokol PCR specifický pro biovar R. solanacearum (Pastrik et al, 2001)

4.1. Oligonukleotidové primery
Přímý primer Rs-1-F: 5'-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3'
Reverzní primer Rs-1-R: 5'-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3'
Reverzní primer Rs-3-R: 5'-TTC ACG GCA AGA TCG CTC-3'
Očekávaná velikost amplikonu templátové DNA R. solanacearum:
s Rs-1-F/Rs-1-R = 718 bp
s Rs-1-F/Rs-3-R = 716 bp

4.2. Reakční směs PCR

a) Protokol PCR specifický pro biovar ¹/₂

Reagencie	Množství v reakci	Konečná koncentrace
Sterilní UPW	12,925 µl
10x pufr PCR⁽¹⁾	2,5 µl	1x (1,5 mM MgCl₂)
BSA (frakce V) (10 %)	0,25 µl	0,1 %
Směs dNTP (20mM)	0,125 µl	0,1 mM
Primer Rs-1-F (10 µM)	2,0 µl	0,8 µM
Primer Rs-1-R (10 µM)	2,0 µl	0,8 µM
Taq polymeráza (5U/µl)⁽¹⁾	0,2 µl	1,0 U
Množství vzorku	5,0 µl
Celkové množství	25,0 µl
(1) Metoda byla validována použitím Taq polymerázy Perkin Elmer (AmpliTaq) a Gibco BRL.

b) Protokol PCR specifický pro Biovar 3/4/5

Reagencie	Množství v reakci	Konečná koncentrace
Sterilní UPW	14,925 µl
10x pufr PCR (1)	2,5 µl	1x (1,5 mM MgCl₂)
BSA (frakce V) (10 %)	0,25 µl	0,1 %
Směs dNTP (20mM)	0,125 µl	0,1 mM
Primer Rs-1-F (10 µM)	1,0 µl	0,4 µM
Primer Rs-3-R (10 µM)	1,0 µl	0,4 µM
Taq polymeráza (5U/µl) (1)	0,2 µl	1,0 U
Množství vzorku	5,0 µl
Celkové množství	25,0 µl
(1)Metoda byla validována použitím Taq polymerázy Perkin Elmer (AmpliTaq) a Gibco BRL.

4.3. Reakční podmínky PCR
Provede se následující cyklický proces pro obě reakce specifické pro biovary 1/2- a biovary 3/4/5:

1 cyklus:	i) 5 minut při 95 °C (denaturace templátové DNA)
35 cyklů:	ii) 30 sekund při 95 °C (denaturace templátové DNA)
	iii) 30 sekund při 58 °C (hybridizace primerů s templátovou DNA)
	iv) 45 sekund při 72 °C (syntéza kopie)
1 cyklus:	v) 5 minut při 72 °C (konečná syntéza)
	vi) ponechá se při teplotě 4 °C.

Poznámka:
Tento program byl optimalizován pro použití termocykleru MJ Research PTC 200. Použití jiných přístrojů může vyžadovat úpravu jednotlivých kroků cyklu ii), iii) a iv).

4.4. Restrikční enzymová analýza amplikonu.
Produkty PCR vzniklé amplifikací DNA R. solanacearum pomocí primerů Rs-1-F a Rs-1-R vytvářejí zřetelný polymorfismus délky restrikčních fragmentů s enzymem Bsm I nebo Isoschizomere (např. Mva 1269 I) po inkubační době 30 minut při teplotě 65 °C. Produkty PCR vzniklé amplifikací z DNA R. solanacearum pomocí primerů Rs-1-F a Rs-3-R nemají žádná restrikční místa.