2. Protokol PCR Pastrika a Maisse (2000)

2.1. Oligonukleotidové primery
Přímý primer Ps-1: 5'-agt cga acg gca gcg ggg g -3'
Reverzní primer Ps-2: 5'-ggg gat ttc aca tcg gtc ttg ca -3
Očekávaná velikost amplikonu templátové DNA R. solanacearum DNA = 553 bp.

2.2. Reakční směs PCR

Reagencie	Množství v reakci	Konečná koncentrace
Sterilní UPW	16,025 µl
10x pufr PCR (1)	2,5 µl	1x (1,5 mM MgCl2)
BSA (frakce V) (10 %)	0,25 µl	0,1 %
Směs dNTP (20mM)	0,125 µl	0,1 mM
Primer Ps-1 (10 µM)	0,5 µl	0,2 µM
Primer Ps-2 (10 µM)	0,5 µl	0,2 µM
Taq polymerasa (5U/µl) (1)	0,1 µl	0,5 U
Množství vzorku	5,0 µl
Celkové množství	25,0 µl
(1) Metoda byla validována použitím Taq polymerázy Perkin Elmer (AmpliTaq) a Gibco BRL. Poznámka: Původně optimalizovaná pro termocykler MJ Research PTC 200 s polymerasou Gibco Taq Polymerace. Perkin Elmer AmpliTaq a pufr mohou být rovněž použity ve stejných koncentracích.

2.3 Reakční podmínky PCR
Provede se následující cyklický proces:

1 cyklus	i) 5 minut při 95 °C (denaturace templátové DNA)
35 cyklů:	ii) 30 sekund při 95 °C (denaturace templátové DNA)
	iii) 30 sekund při 68 °C (hybridizace primerů s templátovou DNA)
	iv) 45 sekund při 72 °C (syntéza kopie)
1 cyklus:	v) 5 minut při 72 °C (syntéza extenze)
	vi) ponechá se při teplotě 4 °C.

Poznámka:
Tento program byl optimalizován pro použití termocykleru MJ Research PTC 200. Použití jiných přístrojů bude možná vyžadovat úpravu jednotlivých kroků cyklu ii), iii) a iv).

2.4. Restrikční enzymová analýza amplikonu
Produkty PCR vzniklé amplifikací z R. solanacearum DNA vytvářejí zřetelný polymorfismus délky restrikčních fragmentů s enzymem Taq I po inkubační době 30 minut při teplotě 65 °C. Restrikční fragmenty specifické pro R. solanacearum mají velikost 457 bp a 96 bp.