3. Protokol pro multiplexní PCR s interní kontrolou (Pastrik et al., 2002)
3.1. Oligonukleotidové primery
Přímý primer RS-1-F: 5'-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3'
Reverzní primer RS-1-R: 5'-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3'
Přímý primer NS-5-F: 5'-AAC TTA AAG GAA TTG ACG GAA G-3'
Reverzní primerNS-6-R: 5'-GCA TCA CAG ACC TGT TAT TGC CTC-3'
Očekávaná velikost amplikonu templátové DNA R. solanacearum = 718 bp (sada primerů RS).
Očekávaná velikost amplikonu interní kontroly PCR 18S rRNA = 310 bp (sada primerů NS).
3.2. Reakční směs PCR
| Reagencie | Množství v reakci | Konečná koncentrace |
|---|---|---|
| Sterilní UPW | 12,625 µl | |
| 10x pufr PCR (1) (15 mM MgCl2) | 2,5 µl | 1x (1,5 mM MgCl2) |
| BSA (frakce V) (10 %) | 0,25 µl | 0,1 % |
| Směs dNTP (20mM) | 0,125 µl | 0,1 mM |
| Primer RS-1-F (10 µM) | 2,0 µl | 0,8 µM |
| Primer RS-1-R (10 µM) | 2,0 µl | 0,8 µM |
| Primer NS-S-F (10 µM)(2) | 0,15 µl | 0,06 µM |
| Primer NS-6-R (10 µM)(2) | 0,15 µl | 0,06 µM |
| Taq polymeráza (5U/µl)(1) | 0,2 µl | 1,0 U |
| Množství vzorku | 5,0 µl | |
| Celkové množství | 25,0 µl | |
| (1) Metoda byla validována použitím Taq polymerázy Perkin Elmer (AmpliTaq) a Gibco BRL. (2) Koncentrace primerů NS-5-F a NS-6-R byly optimalizovány pro výkrojky pletiva pupkových částí hlíz bramboru pomocí homogenizační metody a purifikace DNA podle Pastrika (2000) (viz 6.1.6.1.a)). Použití extrakční metody třepáním nebo jiných metod izolace DNA může vyžadovat nové provedení optimalizace koncentrací reagencií. | ||
3.3. Reakční podmínky PCR
Provede se následující cyklický proces:
| 1 cyklus: | i) 5 minut při 95 °C (denaturace templátové DNA) |
| 35 cyklů: | ii) 30 sekund při 95 °C (denaturace templátové DNA) |
| iii) 30 sekund při 58 °C (hybridizace primerů s templátovou DNA) | |
| iv) 45 sekund při 72 °C (syntéza kopie) | |
| 1 cyklus: | v) 5 minut při 72 °C (konečná syntéza) |
| vi) nechá se při teplotě 4 °C. |
Poznámka:
Tento program byl optimalizován pro použití termocykleru MJ Research PTC 200. Použití jiných přístrojů může vyžadovat úpravu jednotlivých kroků cyklu ii), iii) a iv).
3.4. Restrikční enzymová analýzy amplikonu
Produkty PCR vzniklé amplifikací z DNA R. solanacearum vytvářejí zřetelný polymorfismus délky restrikčních fragmentů s enzymem Bsm I nebo Isoschizomere (např. Mva 1269 I) po inkubační době 30 minut při teplotě 65 °C.