Dodatek 7
Validovaná činidla pro FISH test
1. Oligosondy
Sonda specifická pro R. solanacearum OLI-1-CY3: 5'-ggc agg tag caa gct acc ccc-3'
Nespecifická eubakteriální sonda EUB-338-FITC: 5'-gct gcc tcc cgt agg agt-3'
2. Fixační roztok
[UPOZORNĚNÍ: FIXAČNÍ ROZTOK OBSAHUJE PARAFORMALDEHYD, KTERÝ JE TOXICKÝ. POUŽÍT RUKAVICE A NEVDECHNOUT. DOPORUČUJE SE PRACOVAT V DIGESTOŘI.]
i) Zahřeje se 9 ml molekulárně čisté vody (např. Ultra pure water = (UPW)) na teplotu přibližně 60 °C a přidá se 0,4 g paraformaldehydu. Paraformaldehyd se rozpustí po přidání 5 kapek 1N NaOH a zamíchání magnetickým míchadlem.
ii) Upraví se pH na 7,0 přidáním 1ml fosfátového pufru 0,1 M (PB; pH 7,0) a 5 kapek HCl 1N. Zkontroluje se pH indikačním proužkem a v případě potřeby se upraví pomocí HCl nebo NaOH. [UPOZORNĚNÍ: V ROZTOCÍCH S PARAFORMALEDHYDEM NEPOUŽÍVAT MĚŘIČ PH!]
iii) Přefiltruje se roztok přes membránový filtr 0,22 µm a skladuje se chráněný před prachem při teplotě 4 °C do dalšího použití.
3. 3x Hybmix
| NaCl | 2,7 M |
| Tris-HCl | 60 mM (pH 7,4) |
| EDTA (sterilizovaný přes filtr a autoklávovaný) | 15 mM |
Zředí se až 1x, podle potřeby.
4. Hybridizační roztok
| 1x Hybmix | |
| Sodium dodecyl sulfát (SDS) | 0,01 % |
| Formamid | 30 % |
| Sonda EUB 338 | 5 ng/µl |
| Sonda OLI-1 nebo OLI2 | 5 ng/µl |
Připraví se množství hybridizačního roztoku podle výpočtů v tabulce 1. Pro každé sklíčko (obsahující dvojmo 2 různé vzorky) je třeba 90 µl hybridizačního roztoku.UPOZORNĚNÍ: FORMAMID JE VELMI JEDOVATÝ, NUTNO POUŽÍVAT RUKAVICE A UČINIT POTŘEBNÁ BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ!
Tabulka1. Doporučená množství pro přípravu hybridizační směsi
| Počet sklíček | 1 | 4 | 6 | 8 | 10 |
|---|---|---|---|---|---|
| Sterilní ultra čistá voda | 23,1 | 92,4 | 138,6 | 184,8 | 231,0 |
| 3 x Hybmix | 30,0 | 120,0 | 180,0 | 240,0 | 300,0 |
| 1 % SDS | 0,9 | 3,6 | 5,4 | 7,2 | 9,0 |
| Formamid | 27,0 | 108,0 | 162,0 | 216,0 | 270,0 |
| Sonda EUB 338 (100 ng/µl) | 4,5 | 18,0 | 27,0 | 36,0 | 45,0 |
| Sonda OLI-1 nebo OLI2 (100 ng/µl) | 4,5 | 18,0 | 27,0 | 36,0 | 45,0 |
| Celkové množství | 90,0 | 360,0 | 540,0 | 720,0 | 900,0 |
Poznámka:
Všechny roztoky obsahující světlocitlivé oligosondy se uchovávají v temnu při teplotě - 20 °C. Během použití se chrání před přímým slunečním zářením nebo elektrickým světlem.
5. 0,1M fosfátový pufr, pH 7,0
| Na2HPO4 | 8,52 g |
| KH2PO4 | 5,44 g |
| Destilovaná voda | 1,00 l |
Rozpustí se složky, zkontroluje pH a sterilizuje autoklávováním při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.