1 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.

1.1 ÚVOD
Zkouška s vyšetřením lokálních lymfatických uzlin (LLNA) byla dostatečně validována a uznána, což opravňuje její přijetí jako nové metody^7a). Jedná se o druhou metodu zkoušení na pokusných zvířatech zaměřenou na hodnocení potenciálu chemických látek senzibilizovat kůži. První metoda (B.6) využívá zkoušek na morčatech, a to zvláště maximalizační zkoušku na morčatech a Bühlerův test^7a).
LLNA poskytuje alternativní postup pro identifikaci chemických látek způsobujících senzibilizaci kůže a pro potvrzení, že chemické látky nemají významný potenciál senzibilizovat kůži. To však neznamená, že by se metoda LLNA měla ve všech případech používat namísto zkoušek na morčatech; znamená to spíše, že tato metoda má stejnou hodnotu a že ji lze použít jako alternativní metodu, jejíž pozitivní ani negativní výsledky již nevyžadují žádné další potvrzování.
LLNA poskytuje určité výhody, pokud jde o vědecký pokrok a dobré životní podmínky pokusných zvířat. Metoda zkoumá indukční fázi senzibilizace kůže a poskytuje kvantitativní údaje, které jsou vhodné pro hodnocení vztahu dávky a odezvy. Podrobné údaje o validaci metody LLNA a přehled prací spojených s touto metodou byly publikovány. Kromě toho je třeba poznamenat, že mírně nebo středně silně senzibilizující látky, které se doporučují jako vhodné pozitivní kontrolní látky u zkoušek na morčatech, jsou vhodné také pro metodu LLNA.^7a)
LLNA je metodou in vivo a jako taková neeliminuje používání pokusných zvířat při hodnocení senzibilizující aktivity působící kontaktem. Tato metoda však umožňuje snížit počet pokusných zvířat, která jsou k tomuto účelu nezbytná. Kromě toho LLNA nabízí podstatné zjemnění způsobu, jakým se pokusná zvířata používají ke zkoušení kontaktní senzibilizace. Metoda LLNA je založená na posouzení imunologických jevů navozených chemickými látkami během indukční fáze senzibilizace. Na rozdíl od zkoušek na morčatech metoda LLNA nevyžaduje vyvolávání kožní přecitlivělosti navozené provokační reakcí. Kromě toho metoda LLNA nevyžaduje ani používání adjuvantu, jak je tomu v případě maximalizační zkoušky na morčatech. Díky tomu metoda LLNA snižuje utrpení pokusných zvířat. Ale i přes výhody, které má metoda LLNA ve srovnání s tradičními maximalizačními zkouškami na morčatech, je třeba si uvědomit, že zde existují určitá omezení, která si mohou vyžádat použití tradičních zkoušek na morčatech (např. falešně negativní výsledky při použití LLNA s určitými kovy, falešně pozitivní výsledky u určitých látek způsobujících podráždění kůže)^7a).

1.2 PRINCIP ZKUŠEBNÍ METODY
Základní princip metody LLNA spočívá v tom, že senzibilizátory navozují primární proliferaci lymfocytů v lymfatických uzlinách drenujících místo aplikace chemické látky. Toto zmnožení je úměrné aplikované dávce (a potenciálu alergenu) a poskytuje jednoduchý prostředek pro získání objektivního, kvantitativního měření senzibilizace. LLNA hodnotí tuto proliferaci jako vztah dávka-odezva a za tímto účelem se porovnává proliferace ve zkušebních skupinách s proliferací u skupin, kterým se podává vehikulum. Poměr proliferace u exponovaných skupin a u skupin s vehikulem, nazvaný index stimulace, musí být alespoň 3, než lze zkoušenou látku dále hodnotit jako možný senzibilizátor kůže. Metody, které jsou zde popsané, jsou založené na používání radioaktivního značení pro měření proliferace buněk. Pro hodnocení této proliferace je však možné použít i další koncová vyhodnocení, a to za předpokladu, že jsou zdůvodněná a existují pro ně vhodné vědecké důkazy, včetně úplných citací a popisu metodiky.

1.3 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY

1.3.1 Přípravy

1.3.1.1 Podmínky chovu a krmení
Pokusná zvířata se chovají odděleně. Teplota ve zkušební místnosti pro pokusná zvířata by měla být (22 ± 3) °C. Ačkoliv by relativní vlhkost měla být alespoň 30 % a neměla by s výjimkou čištění místnosti překročit 70 %, je cílem hodnota 50 - 60 %. Osvětlení by mělo být umělé, mělo by se střídat 12 h světla a 12 h tmy, není-li v chovné místnosti denní světlo. Ke krmení lze použít obvyklé krmivo určené pro pokusná zvířata od registrovaného výrobce s neomezenou dodávkou pitné vody. Pokusná zvířata mohou být chována v klecích ve skupinách podle dávky v souladu s příslušným právním předpisem¹⁰), pokud není stanoveno projektem pokusů jinak, ale počet pokusných zvířat v kleci nesmí bránit nerušenému pozorování každého pokusného zvířete.

1.3.1.2 Příprava pokusných zvířat
Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu¹⁰) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých pokusných zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu¹⁰). Před začátkem aplikace látky se všechna pokusná zvířata vyšetří, aby se ověřilo, že nemají žádné pozorovatelné kožní léze.

1.3.2 Zkušební podmínky

1.3.2.1 Pokusná zvířata
Druhem zvoleným pro tuto zkoušku je myš. Používají se mladé dospělé samice myší z kmene CBA/Ca nebo CBA/J, které musí být nullipary a nesmějí být březí. Na začátku podávání dávek by pokusná zvířata měla být přibližně 8 až 12 týdnů stará a odchylky v hmotnosti pokusných zvířat by měly být pouze minimální a neměly by překročit 20 % průměrné hmotnosti. Ostatní kmeny a samci by se měli používat pouze tehdy, je-li k dispozici dostatek údajů, které by dokazovaly, že v rámci reakcí v metodě LLNA skutečně neexistují žádné specifické odlišnosti mezi kmeny nebo pohlavími.

1.3.2.2 Kontrola spolehlivosti
Pozitivní kontroly se používají k prokázání odpovídající účinnosti zkoušky a odborné způsobilosti laboratoře úspěšně provést zkoušky. Pozitivní kontrola by měla vyvolat pozitivní reakci v LLNA při úrovni expozice, u které se očekává zvýšení indexu stimulace (SI) > 3 ve srovnání s negativní kontrolní skupinou. Je třeba zvolit takovou pozitivní kontrolní dávku, aby reakce byla zřetelná, nikoliv však přehnaná. K preferovaným látkám patří 2-benzylidenoktanal (CAS 101-86-0, EINECS 202-983-3) a 2-sulfanylbenzothiazol (CAS 149-30-4, EINECS 205-736-8). Mohou existovat určité okolnosti, za niž lze při řádném zdůvodnění použít jiné kontrolní látky, které splňují výše uvedená kritéria. I když se pro každou zkoušku obvykle vyžaduje pozitivní kontrolní skupina, mohou se rovněž vyskytnout situace, kdy mají zkušební laboratoře k dispozici předchozí údaje o pozitivní kontrole prokazující homogenitu dostatečné reakce během šesti měsíců nebo delšího časového období. V takovém případě může být vhodnější méně četné testování s pozitivními kontrolami v intervalech, které by neměly být delší než 6 měsíců. Ačkoliv by se pozitivní kontrolní látky měly testovat ve vehikulu, o kterém je známo, že vyvolává trvale stejnou reakci (např. aceton, olivový olej), mohou nastat určité situace, kdy je z důvodů požadovaných v právních předpisech nezbytné provést zkoušku s použitím nestandardního vehikula (klinicky/chemicky relevantní receptura přípravku). V takovém případě je třeba testovat možnou interakci pozitivní kontroly s tímto nestandardním vehikulem.

1.3.2.3 Počet pokusných zvířat, úrovně dávek a výběr vehikula
Na každou dávkovou skupinu se použijí alespoň čtyři pokusná zvířata, přičemž se použijí minimálně tři koncentrace zkoušené látky, dále se použije negativní kontrolní skupina, které se podává pouze vehikulum zkoušené látky, a v případě potřeby pozitivní kontrola. Jestliže se shromažďují údaje o jednotlivých pokusných zvířatech, použije se na každou dávkovou skupinu minimálně pět pokusných zvířat. S výjimkou aplikace zkoušené látky se s pokusnými zvířaty v kontrolní skupině zachází naprosto stejným způsobem jako s pokusnými zvířaty v experimentální skupině.
Volba dávkování a vehikula by měla být založena na doporučeních uvedených v literatuře^7a). Dávky se vybírají z řady koncentrací 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % atd. Při výběru tří po sobě jdoucích koncentrací je třeba zvážit již existující údaje o akutní toxicitě a kožní dráždivosti, jsou-li k dispozici, aby nejvyšší koncentrace maximalizovala expozici, ale aby současně nevyvolala systémovou toxicitu a nadměrné podráždění kůže^7a).
Vehikulum by mělo být vybráno tak, aby se maximalizovaly zkušební koncentrace a rozpustnost k přípravě roztoku/suspenze vhodné pro aplikaci zkoušené látky. Upřednostňují se vehikula v následujícím pořadí: aceton/olivový olej (4:1 obj.), N,N-dimethylformamid, ethylmethylketon, propan-1,2-diol a dimethylsulfoxid^7a), avšak mohou být použita i jiná vehikula, jsou-li předloženy dostatečné vědecké důvody. V určitých případech může být nezbytné použít jako doplňující kontrolu klinicky relevantní rozpouštědlo nebo komerční recepturu přípravku, v němž je zkoušená látka uváděna na trh. Zvláštní pozornost je třeba věnovat zajištění toho, aby byly hydrofilní materiály zapracovány do takového vehikula, které zvlhčí kůži a nesteče ihned z pokožky. Z tohoto důvodu není vhodné používat jako vehikulum pouze vodu.

1.3.3 Zkušební postup

1.3.3.1 Harmonogram zkoušky
Harmonogram zkoušky je následující:
• Den 1:
Každé pokusné zvíře se individuálně zváží a zaznamená se jeho hmotnost. Provede se otevřená aplikace 25 μl příslušného ředění zkoušené látky, samotného vehikula nebo pozitivní kontrolní látky (podle vhodnosti) na dorsální část obou uší.
• Den 2 a 3:
Zopakuje se postup aplikace provedený v den 1.
• Den 4 a 5:
Žádná aplikace.
• Den 6:
Zaznamená se hmotnost každého pokusného zvířete. Přes ocasní žílu se všem pokusným i kontrolním myším vpíchne 250 μl fyziologického roztoku ve fosfátovém pufru (PBS), obsahujícího 20 μCi (7,4·10⁵Bq) [³H]thymidinu (tritiováném na methylu), nebo lze všem myším přes ocasní žílu vpíchnout 250 μl PBS obsahujícího 2μCi (7,4·10⁴Bq) [¹²⁵I]joddeoxyuridinu a 10^-5M fiuordeoxyuridinu.
O pět hodin později se myši usmrtí. Drenující aurikulární lymfatické uzliny z obou uší se vyjmou a shromáždí se v PBS společně pro celou zkušební skupinu (metoda sdružení exponované skupiny), nebo se od každého pokusného zvířete vyjme pár lymfatických uzlin a uloží se do PBS individuálně pro každé pokusné zvíře (metoda individuálního přístupu k pokusným zvířatům)^7a).

1.3.3.2 Příprava buněčné suspenze
Jedna společná buněčná suspenze s buňkami lymfatických uzlin (LNC) buď od celé exponované skupiny, nebo bilaterálně od jednotlivých pokusných zvířat se připraví pomocí jemné mechanické deagregace přes 200 µm sítka z korozivzdorné oceli. Lymfatické buňky se dvakrát propláchnou v dostatečném množství PBS a nechají se vysrážet v roztoku s 5 % trichloroctovou kyselinou (TCA) při 4 °C po dobu 18 h^7a). Sediment se buď resuspenduje v 1 ml TCA a přemístí do scintilačních kyvet obsahujících 10 ml kapalného scintilátoru pro měření aktivity ³H, nebo se přenese přímo do zkumavek pro měření aktivity ¹²⁵I.

1.3.3.3 Stanovení buněčné proliferace (inkorporované radioaktivity)
Inkorporace [³H]thymidinu se měří β-scintilační metodou a vyjádří se v rozpadech za minutu (dpm). Inkorporace [¹²⁵I]joddeoxyuridinu se měří prostřednictvím aktivity ¹²⁵I a rovněž se vyjádří v dpm. V závislosti na použitém přístupu se inkorporace vyjádří v dpm na zkušební skupinu (metoda sdružení) nebo v dpm na pokusné zvíře (individuální přístup).

1.3.3.4 Pozorování

1.3.3.4.1 Klinická pozorování
Pokusná zvířata je třeba jednou denně pečlivě vyšetřit na jakékoli klinické příznaky, ať již ve formě lokálního podráždění v místě aplikace, nebo ve formě systémové toxicity. Všechna sledování se systematicky zaznamenávají, přičemž záznamy se vedou zvlášť pro každé pokusné zvíře.

1.3.3.4.2 Tělesná hmotnost
Jak je uvedeno v odstavci 1.3.3.1, tělesnou hmotnost u jednotlivých pokusných zvířat je třeba zaznamenat na začátku zkoušky a v den plánovaného usmrcení pokusných zvířat.

1.3.4 Výpočet výsledků
Výsledky se vyjádří jako index stimulace (SI). Při metodě sdružení exponované skupiny se SI stanoví jako podíl sdružené inkorporované aktivity u jednotlivých experimentálních skupin a sdružené radioaktivity kontrolní skupiny s vehikulem; získá se tak průměrná hodnota SI. Při individuálním přístupu se SI stanoví jako podíl průměrné hodnoty dpm na pokusné zvíře jak u každé exponované skupiny, tak u pozitivní kontrolní skupiny, a průměrné hodnoty dpm na pokusné zvíře u kontrolní skupiny s rozpouštědlem/vehikulem. Průměrná hodnota SI pro kontrolní skupiny s vehikulem je proto 1.
Použití individuálního přístupu při výpočtu SI umožní provést statistickou analýzu dat. Při výběru vhodné metody pro statistickou analýzu si musí být experimentátor vědom možných nestejných odchylek a jiných souvisejících problémů, které si mohou vyžádat transformaci dat nebo neparametrickou statistickou analýzu. Správný přístup k analýze dat spočívá ve vyhodnocení veškerých individuálních dat exponovaných pokusných zvířat a kontrol s vehikulem a proložení regresní křivky závislosti odezvy na dávce při zohlednění intervalů spolehlivosti^7a). V každém případě si však experimentátor musí uvědomovat možné „odlehlé“ reakce u jednotlivých pokusných zvířat v rámci skupiny, které mohou vyžadovat použití jiného hodnocení odezvy (např. použití mediánu namísto průměru) nebo vyřazení těchto odlehlých hodnot.
Do rozhodování, zda jde o pozitivní odezvu, se zahrnuje index stimulace ≥ 3 a zohledňuje se závislost odezvy na dávce a popřípadě statistická významnost.^7a)
Je-li nezbytné objasnit získané výsledky, je třeba věnovat pozornost různým vlastnostem zkoušené látky, včetně toho, zda se její struktura podobá struktuře známých senzibilizátorů kůže, zda způsobuje nadměrné podráždění kůže a také povaze zjištěné závislosti odezvy na dávce^7a).