1.3.3 Zkušební postup

1.3.3.1 Harmonogram zkoušky
Harmonogram zkoušky je následující:
• Den 1:
Každé pokusné zvíře se individuálně zváží a zaznamená se jeho hmotnost. Provede se otevřená aplikace 25 μl příslušného ředění zkoušené látky, samotného vehikula nebo pozitivní kontrolní látky (podle vhodnosti) na dorsální část obou uší.
• Den 2 a 3:
Zopakuje se postup aplikace provedený v den 1.
• Den 4 a 5:
Žádná aplikace.
• Den 6:
Zaznamená se hmotnost každého pokusného zvířete. Přes ocasní žílu se všem pokusným i kontrolním myším vpíchne 250 μl fyziologického roztoku ve fosfátovém pufru (PBS), obsahujícího 20 μCi (7,4·10⁵Bq) [³H]thymidinu (tritiováném na methylu), nebo lze všem myším přes ocasní žílu vpíchnout 250 μl PBS obsahujícího 2μCi (7,4·10⁴Bq) [¹²⁵I]joddeoxyuridinu a 10^-5M fiuordeoxyuridinu.
O pět hodin později se myši usmrtí. Drenující aurikulární lymfatické uzliny z obou uší se vyjmou a shromáždí se v PBS společně pro celou zkušební skupinu (metoda sdružení exponované skupiny), nebo se od každého pokusného zvířete vyjme pár lymfatických uzlin a uloží se do PBS individuálně pro každé pokusné zvíře (metoda individuálního přístupu k pokusným zvířatům)^7a).

1.3.3.2 Příprava buněčné suspenze
Jedna společná buněčná suspenze s buňkami lymfatických uzlin (LNC) buď od celé exponované skupiny, nebo bilaterálně od jednotlivých pokusných zvířat se připraví pomocí jemné mechanické deagregace přes 200 µm sítka z korozivzdorné oceli. Lymfatické buňky se dvakrát propláchnou v dostatečném množství PBS a nechají se vysrážet v roztoku s 5 % trichloroctovou kyselinou (TCA) při 4 °C po dobu 18 h^7a). Sediment se buď resuspenduje v 1 ml TCA a přemístí do scintilačních kyvet obsahujících 10 ml kapalného scintilátoru pro měření aktivity ³H, nebo se přenese přímo do zkumavek pro měření aktivity ¹²⁵I.

1.3.3.3 Stanovení buněčné proliferace (inkorporované radioaktivity)
Inkorporace [³H]thymidinu se měří β-scintilační metodou a vyjádří se v rozpadech za minutu (dpm). Inkorporace [¹²⁵I]joddeoxyuridinu se měří prostřednictvím aktivity ¹²⁵I a rovněž se vyjádří v dpm. V závislosti na použitém přístupu se inkorporace vyjádří v dpm na zkušební skupinu (metoda sdružení) nebo v dpm na pokusné zvíře (individuální přístup).

1.3.3.4 Pozorování

1.3.3.4.1 Klinická pozorování
Pokusná zvířata je třeba jednou denně pečlivě vyšetřit na jakékoli klinické příznaky, ať již ve formě lokálního podráždění v místě aplikace, nebo ve formě systémové toxicity. Všechna sledování se systematicky zaznamenávají, přičemž záznamy se vedou zvlášť pro každé pokusné zvíře.

1.3.3.4.2 Tělesná hmotnost
Jak je uvedeno v odstavci 1.3.3.1, tělesnou hmotnost u jednotlivých pokusných zvířat je třeba zaznamenat na začátku zkoušky a v den plánovaného usmrcení pokusných zvířat.