3 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
V souladu s příslušnými právními předpisy⁹),¹⁰) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.
TABULKA 9: HODNOCENÍ KOŽNÍCH REAKCÍ
Tvorba erytému a příškvaru

Žádný erytém	0
Velmi slabý erytém (sotva patrný)	1
Zřetelně viditelný erytém	2
Mírný až výrazný erytém	3
Těžký erytém (silné zrudnutí) nebo tvorba příškvaru znemožňující posouzení erytému	4

Maximálně možné: 4
Tvorba edému

Žádný edém	0
Velmi lehký edém (sotva patrný)	1
Lehký edém (okraje jsou patrné, plocha je ohraničena zřetelným vyvýšením)	2
Mírný edém (okraje vyvýšeny asi o 1 mm)	3
Výrazný edém (zduření více než 1 mm a otok přesahující hranice exponované plochy)	4

Maximálně možné: 4
Pro objasnění sporných reakcí lze provést histopatologické vyšetření.
Tabulka 8
Strategie postupného zkoušení dráždivých a leptavých účinků na kůži
OBECNÉ ÚVAHY
V zájmu spolehlivého vědeckého přístupu a dobrého zacházení s pokusnými zvířaty je důležité vyhýbat se zbytečnému používání pokusných zvířat a minimalizovat jakékoli zkoušky, které u pokusných zvířat pravděpodobně vyvolají závažné reakce. Veškeré informace týkající se potenciálních leptavých/dráždivých účinků látky na kůži by se měly zhodnotit před zvažováním zkoušení in vivo. Může již existovat dostatek důkazů pro klasifikaci zkoušené látky podle jejího potenciálu vyvolávat leptavé nebo dráždivé účinky na kůži, aniž by bylo nutné provádět zkoušky na pokusných zvířatech. Proto využití analýzy průkaznosti výsledků a strategie postupného zkoušení sníží potřebu provádět zkoušení in vivo, zejména pokud látka pravděpodobně vyvolá závažné reakce.
Doporučuje se, aby se stávající informace týkající se dráždivých nebo leptavých účinků látky na kůži zhodnotily pomocí analýzy průkaznosti výsledků, na jejímž základě se rozhodne o tom, zda by se k lepší charakteristice tohoto potenciálu měly provést další studie jiné než kožní studie in vivo. Jsou-li nutné další studie, doporučuje se využít strategie postupného zkoušení a její pomocí získat relevantní experimentální údaje. U látek, které doposud nebyly zkoušeny, by měla být strategie postupného zkoušení využita k získání souboru údajů, které jsou nezbytné k vyhodnocení jejich potenciálních leptavých nebo dráždivých účinků. Strategie zkoušení popsaná v této tabulce 8 byla vypracována na semináři OECD^7a) a později potvrzena a rozpracována v Harmonizovaném integrovaném systému klasifikace nebezpečí chemických látek pro lidské zdraví a jejich vlivu na životní prostředí, který schválilo 28. společné zasedání Výboru pro chemické látky a Pracovní skupiny pro chemické látky v listopadu 1998^7a).
Ačkoliv tato strategie postupného zkoušení není nedílnou součástí zkušební metody B.4, vyjadřuje doporučovaný postup stanovení dráždivých/leptavých účinků na kůži. Tento postup představuje nejlepší praktický i etický standard pro zkoušení dráždivých/leptavých účinků na kůži in vivo. Metoda zkoušení poskytuje pokyny pro provádění zkoušky in vivo a shrnuje faktory, které by před zahájením takové zkoušky měly být zváženy. Tato strategie představuje přístup posuzování existujících údajů o dráždivých/leptavých účincích zkoušených látek a odstupňovaný přístup k vytváření relevantních údajů o látkách, u kterých je nutné provést další studie, nebo u nichž žádné studie nebyly doposud provedeny. Doporučuje se také za určitých okolností provést validované a uznané zkoušky in vitro nebo ex vivo na zjištění dráždivých/leptavých účinků na kůži.
POPIS STRATEGIE VYHODNOCOVÁNÍ A ZKOUŠENÍ
Před zahájením zkoušek v rámci strategie postupného zkoušení (tabulka 8 pokračování) se vyhodnotí veškeré dostupné informace, aby se mohlo rozhodnout o nutnosti provést zkoušení in vivo. Ačkoliv lze významné informace získat z vyhodnocení jednotlivých parametrů (např. extrémní hodnota pH), stávající informace by se měly vzít v úvahu jako celek. Všechny relevantní údaje o účincích dotyčné látky nebo jejích obdob se vyhodnotí na základě rozhodnutí založeném na průkaznosti výsledků. Mělo by se podat zdůvodnění tohoto rozhodnutí. Hlavní důraz by se měl klást na již existující údaje o účincích látky na člověka a zvířata a dále na výsledky zkoušení in vitro nebo ex vivo. Studie žíravých látek in vivo by se měly provádět co nejméně. Mezi faktory uvedené ve strategii zkoušení patří:
Hodnocení existujících údajů o účincích látky na člověka a zvířata (krok 1). Nejprve je nutné vzít v úvahu existující údaje o účincích na člověka, např. klinické studie nebo studie nemocí z povolání, záznamy subjektů hodnocení nebo údaje o zkouškách na pokusných zvířatech, např. z jednorázových nebo opakovaných studií dermální toxicity, protože z těchto údajů lze získat informace přímo se vztahující k účinkům na kůži. Látky, jejichž dráždivé nebo leptavé účinky jsou známy, a látky, o nichž existují jednoznačné důkazy, že leptavé nebo dráždivé účinky nemají, není nutné zkoušet ve studiích in vivo.
Analýza vztahů mezi strukturou a biologickou aktivitou (SAR) (krok 2). Vezmou se v úvahu výsledky zkoušek strukturně příbuzných látek, jsou-li k dispozici. Pokud jsou k dispozici dostatečné údaje o účincích strukturně příbuzných látek nebo jejich směsí na člověka nebo pokusná zvířata naznačující, že mají potenciál leptavých/dráždivých účinků, lze předpokládat, že hodnocená zkoušená látka vyvolá stejné reakce. V takových případech není nutné tuto látku zkoušet. Negativní údaje získané ze studií strukturně příbuzných látek nebo jejich směsí nezakládají podle strategie postupného zkoušení dostatečný důkaz o neexistenci leptavých/dráždivých účinků látky. Ke stanovení potenciálních leptavých a dráždivých účinků na kůži by měly být použity validované a uznané postupy vycházející z analýzy SAR.
Fyzikálně-chemické vlastnosti a chemická reaktivita (krok 3). Látky vykazující extrémní hodnoty pH jako ≤ 2,0 a ≥ 11,5 mohou mít silné místní účinky. Pokud se leptavé účinky látky na kůži stanoví na základě extrémních hodnot pH, lze také vzít v úvahu kyselou/alkalickou rezervu (pufrační kapacitu)^7a). Pokud lze podle pufrační kapacity soudit, že látka možná nemá leptavé účinky na kůži, musí tento předpoklad potvrdit další zkoušky, pokud možno s využitím validované a uznané zkoušky in vitro nebo ex vivo (viz kroky 5 a 6).
Dermální toxicita (krok 4). Pokud se ukáže, že chemická látka je při podání dermální cestou vysoce toxická, nemusí být studie dráždivých/leptavých účinků na kůži in vivo, neboť množství zkoušené látky, které se obvykle nanáší, by mohlo přesáhnout vysoce toxickou dávku a mít za následek uhynutí nebo závažné utrpení pokusných zvířat. Navíc pokud byly studie dermální toxicity využívající albíny králíka již provedeny do limitní úrovně dávky 2 000 mg/kg tělesné hmotnosti nebo vyšší a nebyly zjištěny žádné dráždivé nebo leptavé účinky, nemusí být další zkoušky dráždivých/leptavých účinků na kůži nezbytné. Při hodnocení akutní dermální toxicity v předchozích studiích je nutné mít na paměti několik aspektů. Např. zaznamenané informace o dermálních lezích nemusí být úplné. Zkoušení a pozorování mohlo být prováděno na jiných druzích než králík a citlivost reakcí jednotlivých druhů se může do značné míry lišit. Také forma zkoušené látky, která byla pokusným zvířatům podávána, nemusela být vhodná pro hodnocení dráždivých/leptavých účinků na kůži (např. ředění látek určených ke zkoušení dermální toxicity)^7a). Avšak v takových případech, kdy byly na králících provedeny dobře navržené a realizované studie dermální toxicity, lze negativní nálezy považovat za dostatečné důkazy, že látka není žíravá nebo dráždivá.
Výsledky ze zkoušek in vitro nebo ex vivo (kroky 5 a 6). Látky, které vykazovaly leptavé nebo výrazně dráždivé účinky ve validované a uznané zkoušce in vitro nebo ex vivo^7a), jejímž cílem bylo hodnocení specifických účinků, není nutné zkoušet na pokusných zvířatech. Lze předpokládat, že takové látky vyvolají ve zkoušce in vivo podobné závažné účinky.
Zkouška in vivo na králících (kroky 7 a 8). Pokud je k provedení zkoušení in vivo nutné rozhodnutí založené na průkaznosti výsledku, mělo by toto zkoušení začínat s počáteční zkouškou na jednom pokusném zvířeti. Pokud výsledky této zkoušky naznačují, že látka má leptavé účinky na kůži, nemělo by se další zkoušení provádět. Pokud během počáteční zkoušky není pozorován leptavý účinek, měla by se dráždivá nebo negativní reakce potvrdit maximálně na dvou dalších pokusných zvířatech po dobu expozice 4 h. Pokud je během počáteční zkoušky pozorován dráždivý účinek, lze potvrzující zkoušku provést postupně, nebo exponováním dvou dalších pokusných zvířat současně.
Tabulka 8 pokračování
STRATEGIE ZKOUŠENÍ A HODNOCENÍ DRÁŽDIVÝCH/LEPTAVÝCH ÚČINKŮ NA KŮŽI

3.1 Zpráva o průběhu pokusu obsahuje tyto informace:
Zdůvodnění zkoušení in vivo: analýza průkaznosti výsledků předchozích pokusů, včetně výsledků strategie postupného zkoušení:
— popis relevantních údajů z předchozích zkoušek,
— údaje získaná v každé fázi strategie zkoušení,
— popis provedených zkoušek in vitro, včetně podrobných údajů o postupech a o výsledcích získaných se zkoušenými/referenčními látkami,
— analýza průkaznosti výsledků odůvodňující provedení studie in vivo.
Zkoušená látka:
— identifikační údaje (např. číslo CAS, zdroj, čistota, známé nečistoty, šarže),
— fyzikální povaha a fyzikálně-chemické vlastnosti (např. pH, těkavost, rozpustnost, stabilita),
— pokud jde o směs, její složení a relativní podíl složek vyjádřený v procentech.
Vehikulum:
— identifikace, koncentrace (podle potřeby), použitý objem,
— zdůvodnění výběru vehikula.
Pokusná zvířata:
— použitý druh/kmen, zdůvodnění použití jiných pokusných zvířat, není-li použit albín králíka,
— počet pokusných zvířat každého pohlaví,
— hmotnosti jednotlivých pokusných zvířat na začátku a v závěru zkoušky,
— stáří na začátku studie,
— původ pokusných zvířat, podmínky chovu, krmivo atd.
Zkušební podmínky:
— technika přípravy oblasti kůže, na níž se nanese náplast,
— podrobné údaje o materiálech použitých na náplasti a technice aplikování náplastí,
— podrobné údaje o přípravě zkoušené látky, jejím nanesení a odstranění.
Výsledky:
— údaje o stupni odezvy na dráždivé nebo leptavé účinky u každého pokusného zvířete ve všech okamžicích měření,
— popis všech pozorovaných lézí,
— podrobný popis povahy a stupně pozorovaných dráždivých nebo leptavých účinků a případné histopatologické nálezy,
— popis jiných místních (např. odtučnění kůže) a systémových účinků vedle dráždivých nebo leptavých účinků na kůži.
Diskuse a interpretace výsledků.
Závěry.