3 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
V souladu s příslušnými právními předpisy⁹),¹⁰) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.
TABULKA 11: STUPNICE OČNÍCH LÉZÍ
Rohovka
Zákal: stupeň hustoty (vyšetří se nejvíce zakalené oblasti)*

Žádné zvředovatění ani zákal	0
Rozptýlené nebo difúzní oblasti zákalu (jiné než slabé zastření normálního lesku), detaily duhovky jasně viditelné	1
Snadno identifikovatelná průhledná oblast, detaily duhovky lehce zastřené	2
Přítomnost zóny opalescence, detaily duhovky nejsou viditelné, velikost zornice stěží rozeznatelná	3
Úplná neprůhlednost rohovky, duhovka je zcela neviditelná	4

Maximálně možné: 4
* Zaznamená se oblast zákalu rohovky.
Duhovka

Normální	0
Výrazně prohloubené řasy, městnání, otoky, střední překrvení kolem rohovky, nebo překrvení při zánětu; rohovka reaguje na světlo (zpožděná reakce je považována za účinek)	1
Krvácení, makroskopické poškození nebo bez reakce na světlo	2

Maximálně možné: 2
Spojivky
Zčervenání (podle nejzávažnější změny pozorované na víčkové nebo bulbární spojivce, kromě rohovky a duhovky)

Normální	0
Některé krevní cévy hyperemické (překrvené)	1
Difúzní, rudá barva, jednotlivé cévy nesnadno rozeznatelné	2
Difúzní temně rudá barva	3

Maximálně možné: 3
Otoky (chemosis) (týká se víček nebo slzných žláz)

Normální	0
Slabě abnormální otok	1
Patrný otok, s částečným obrácením víček	2
Otok způsobující uzavření víček zhruba na polovinu	3
Otok způsobující uzavření víček více než na polovinu	4

Maximálně možné: 4
Tabulka 10
Strategie postupného zkoušení dráždivých a leptavých účinků na oči
OBECNÉ ÚVAHY
V zájmu spolehlivého vědeckého přístupu a dobrého zacházení s pokusnými zvířaty je důležité vyhýbat zbytečnému používání pokusných zvířat a minimalizovat jakékoli zkoušky, které u pokusných zvířat pravděpodobně vyvolají závažné reakce. Veškeré informace týkající se potenciálních leptavých/dráždivých účinků látky na oči by se měly zhodnotit před zvažováním zkoušení in vivo. Může již existovat dostatek důkazů pro klasifikaci zkoušené látky podle jejího potenciálu dráždivých nebo leptavých účinků na oči, aniž by bylo nutné provádět zkoušky na pokusných zvířatech. Proto využití analýzy průkaznosti výsledků a strategie postupného zkoušení sníží potřebu provádět zkoušení in vivo, zejména pokud látka pravděpodobně vyvolá závažné reakce.
Doporučuje se, aby se stávající informace týkající se dráždivých a leptavých účinků látky na oči zhodnotily pomocí analýzy průkaznosti výsledků, na jejímž základě se rozhodne o tom, zda by se k lepší charakteristice tohoto potenciálu měly provést další studie jiné než oční studie in vivo. Jsou-li nutné další studie, doporučuje se využít strategie postupného zkoušení a jejím prostřednictvím získat relevantní experimentální údaje. U látek, které doposud nebyly zkoušeny, by se měla strategie postupného zkoušení využít k získání údajů, které jsou nezbytné k vyhodnocení jejich leptavých nebo dráždivých účinků na oči. Strategie zkoušení popsaná v této tabulce 10 byla vypracována na semináři OECD^7a). Následně byla tato strategie potvrzena a rozpracována v Harmonizovaném integrovaném systému klasifikace nebezpečí chemických látek pro lidské zdraví a jejich vlivu na životní prostředí, který schválilo 28. společné zasedání Výboru pro chemické látky a Pracovní skupiny pro chemické látky v listopadu 1998^7a).
Ačkoliv tato strategie postupného zkoušení není nedílnou součástí zkušební metody B.5, vyjadřuje doporučovaný postup stanovení dráždivých/leptavých účinků na oči. Tento postup představuje nejlepší praktický i etický standard pro zkoušení dráždivých/leptavých účinků na oči in vivo. Metoda zkoušení poskytuje pokyny pro provádění zkoušky in vivo a shrnuje faktory, kterým je nutno před zvažováním takové zkoušky věnovat pozornost. Strategie postupného zkoušení představuje přístup posuzování existujících údajů o dráždivých a leptavých účincích látek na oči a odstupňovaný přístup k získávání relevantních údajů o látkách, u kterých je nutné provést další studie, nebo u nichž žádné studie nebyly doposud provedeny. Součástí této strategie je provedení nejprve validovaných a uznaných zkoušek in vitro nebo ex vivo a poté za určitých okolností provedení studií dráždivých/leptavých účinků na kůži metodou zkoušení B.4.^7a)
POPIS STRATEGIE ZKOUŠENÍ PO KROCÍCH
Před zahájením zkoušek v rámci strategie postupného zkoušení (tabulka 10 pokračování) se vyhodnotí veškeré dostupné informace, aby se mohlo rozhodnout o nutnosti provést zkoušení in vivo. Ačkoliv lze významné informace získat z vyhodnocení jednotlivých parametrů (např. extrémní hodnota pH), stávající informace by se měly hodnotit jako celek. Všechny relevantní údaje o účincích zkoušené látky a jejích strukturních obdob se vyhodnotí na základě rozhodnutí založeném na průkaznosti výsledků. Mělo by se podat zdůvodnění tohoto rozhodnutí. Hlavní důraz by se měl klást na již existující údaje o účincích látky na člověka a zvířata a dále na výsledky zkoušení in vitro nebo ex vivo. Studie žíravých látek in vivo by se měly provádět co nejméně. Mezi faktory uvedené ve strategii zkoušení patří:
Hodnocení existujících údajů o účincích látky na člověka a zvířata (krok 1). Nejprve je nutné vzít v úvahu existující údaje o účincích na člověka, např. klinické studie nebo studie nemocí z povolání, záznamy subjektů hodnocení nebo údaje o zkouškách na pokusných zvířatech získaná z očních studií, protože z těchto dat lze získat informace přímo se vztahující k účinkům na oči. Poté se zhodnotí dostupné údaje ze studií na lidech nebo na pokusných zvířatech zabývajících se leptavými/dráždivými účinky na kůži. Látky, jejichž leptavé nebo vysoce dráždivé účinky na oči jsou známy, se do očí pokusných zvířat neaplikují. To platí rovněž pro látky vykazující leptavé nebo dráždivé účinky na kůži; takové látky se považují za látky s leptavými nebo dráždivými účinky rovněž na oči. Látky, o nichž byly v předchozích očních studiích získány dostatečné důkazy, že jsou nežíravé a nedráždivé, se v očních studiích in vivo také nezkoušejí.
Analýza vztahů mezi strukturou a biologickou aktivitou (SAR) (krok 2). Vezmou se v úvahu výsledky zkoušek strukturně příbuzných chemických látek, jsou-li k dispozici. Pokud jsou k dispozici dostatečné údaje o účincích strukturně příbuzných látek nebo jejich směsí na člověka nebo zvířata naznačující, že mají potenciál leptavých/dráždivých účinků na oči, lze předpokládat, že zkoušená látka vyvolá stejné reakce. V takových případech není nutné tuto látku zkoušet. Negativní údaje získané ze studií strukturně příbuzných látek nebo jejich směsí nezakládají podle strategie postupného zkoušení dostatečný důkaz nežíravosti/nedráždivosti látky. Ke stanovení potenciálu leptavých/dráždivých účinků na kůži i oči by měl být použity validované a uznané postupy vycházející z analýzy SAR.
Fyzikálně-chemické vlastnosti a chemická reaktivita (krok 3). Látky vykazující extrémní hodnoty pH jako ≤ 2,0 nebo ≥ 11,5 mohou mít silné místní účinky. Pokud se leptavé nebo dráždivé účinky látky na oči stanoví na základě extrémních hodnot pH, lze také vzít v úvahu kyselou/alkalickou rezervu (pufrační kapacitu)^7a). Pokud lze podle pufrační kapacity soudit, že látka možná nemá leptavé účinky na oči, musí tento předpoklad potvrdit další zkoušky, pokud možno s využitím validované a uznané zkoušky in vitro nebo ex vivo (viz kroky 5 a 6).
Zvážení dalších existujících informací (krok 4). V této fázi se vyhodnotí veškeré dostupné informace o systémové toxicitě dermální cestou. Vezme se v úvahu také akutní dermální toxicita zkoušené látky. Pokud se u zkoušené látky ukázalo, zeje při podání dermální cestou vysoce toxická, nemusí být nutné zkoušet ji na oku. Ačkoliv mezi akutní dermální toxicitou a dráždivými/leptavými účinky na oči nemusí nezbytně existovat souvislost, lze se domnívat, že pokud je látka při podání dermální cestou vysoce toxická, bude vysokou toxicitu vykazovat také při instilaci podání do oka. Takové údaje lze také vzít v úvahu mezi kroky 2 a 3.
Výsledky ze zkoušek in vitro nebo ex vivo (kroky 5 a 6). Látky, které vykazovaly leptavé nebo výrazně dráždivé vlastnosti ve zkoušce in vitro nebo ex vivo^7a), která byla validována a uznána pro hodnocení výlučně leptavých/dráždivých účinků na oči nebo na kůži, není nutné zkoušet na pokusných zvířatech. Lze předpokládat, že takové látky vyvolají ve zkoušce in vivo podobné závažné účinky. Nejsou-li validované a uznané zkoušky in vitro nebo ex vivo k dispozici, kroky 5 a 6 se přeskočí a přejde se přímo ke kroku 7.
Posouzení dráždivých nebo leptových účinků na kůži in vivo (krok 7). Pokud stávající důkazy k provedení přesvědčivé analýzy průkaznosti výsledků potenciálních dráždivých/leptavých účinků látky na oči opírající se o údaje z výše uvedených studií nepostačují, nejprve se s využitím metody B.4^7a) a průvodní přílohy^7a) vyhodnotí potenciál dráždivých/leptavých účinků na kůži in vivo. Jestliže se u látky prokáží leptavé nebo silné dráždivé účinky na kůži, považuje se za látku s leptavými a dráždivými účinky na oči, pokud odlišný závěr nepodporují jiné informace. Oční zkoušku in vivo by tak nebylo nutné provádět. Pokud látka leptavé nebo výrazně dráždivé účinky na kůži nemá, oční zkouška in vivo se provede.
Zkouška in vivo na králících (kroky 8 a 9). Oční zkoušení in vivo se zahájí počáteční zkouškou na jednom pokusném zvířeti. Pokud výsledky této zkoušky naznačují, že látka má silně dráždivé nebo leptavé účinky na oči, nemělo by se další zkoušení provádět. Pokud zkouška žádné leptavé nebo silně dráždivé účinky neodhalí, provede se potvrzující zkouška na dvou dalších pokusných zvířatech.
Tabulka 10 pokračování
STRATEGIE ZKOUŠENÍ A HODNOCENÍ DRÁŽDIVÝCH/LEPTAVÝCH ÚČINKŮ NA OČI

3.1 Zpráva o průběhu pokusu obsahuje následující informace.
zdůvodnění zkoušení in vivo: analýza průkaznosti výsledků předchozích pokusů, včetně výsledků strategie postupného zkoušení:
— popis relevantních údajů z předchozích zkoušek,
— údaje získané v každém kroku strategie zkoušení,
— popis provedených zkoušek in vitro, včetně podrobných údajů o postupech a o výsledcích získaných se zkoušenými/referenčními látkami,
— popis provedené studie dráždivých/leptavých účinků na kůži in vivo, včetně získaných výsledků,
— analýza průkaznosti výsledků odůvodňující provedení studie in vivo.
Zkoušená látka:
— identifikační údaje (např. číslo CAS, zdroj, čistota, známé nečistoty, šarže),
— fyzikální povaha a fyzikálně-chemické vlastnosti (např. hodnota pH, těkavost, rozpustnost, stabilita, reaktivita s vodou),
— v případě směsi její složení a relativní podíl složek vyjádřený v procentech,
— je-li použito lokální anestetikum, jeho identifikace, čistota, typ, dávka a potenciální interakce se zkoušenou látkou.
Vehikulum:
— identifikace, koncentrace (podle potřeby), použitý objem,
— zdůvodnění výběru vehikula.
Pokusná zvířata:
— použitý druh/kmen, zdůvodnění použití jiných pokusných zvířat, není-li použit albín králíka,
— stáří každého pokusného zvířete na začátku studie,
— počet pokusných zvířat každého pohlaví ve zkušebních a kontrolních skupinách (je-li to nutné),
— hmotnosti jednotlivých pokusných zvířat na začátku a na konci zkoušky,
— původ, podmínky chovu, krmivo atd.
Výsledky:
— popis metody vyhodnocení dráždivosti při každém pozorování (např. ruční štěrbinová lampa, biomikroskop, fluorescein),
— údaje ve formě tabulky o reakcích na dráždivé nebo leptavé účinky u jednotlivých pokusných zvířat při každém pozorování až do vyjmutí každého pokusného zvířete ze zkoušky,
— podrobný popis stupně a charakteru pozorovaných dráždivých nebo leptavých účinků,
— popis všech dalších pozorovaných očních lézí (např. vaskularizace, tvorba panu, srůst sousedních tkání, zbarvení),
— popis místních a systémových nepříznivých účinků mimo oči a případné histopatologické nálezy.
Diskuse a interpretace výsledků.
Extrapolace výsledků studií dráždivých účinků na oči pokusných zvířat na člověka je platná jen v omezené míře. Albinotický králík je ve většině případů na dráždivé a žíravé látky pro oči citlivější než člověk.
Je třeba dbát na to, aby byla při interpretaci údajů vyloučena dráždivost pramenící ze sekundární infekce.
Závěry.