13. KVALITATIVNÍ A KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ VOLNÉHO FORMALDEHYDU
1. ROZSAH A OBLAST POUŽITÍ
Tato metoda popisuje kvalitativní stanovení a dva způsoby kvantitativního stanovení v závislosti na tom, zda jsou či nejsou přítomny donory formaldehydu. Je použitelná pro všechny kosmetické prostředky a skládá se ze tří částí:
1.1 Kvalitativní stanovení
1.2 Obecné kolorimetrické stanovení pomocí pentan-2,4-dionu (acetylaceton)
Tato metoda se používá v případě, je-li použit formaldehyd samotný nebo s konzervanty, které nejsou donory formaldehydu.
V opačném případě, a pokud výsledek přesáhne nejvyšší povolenou koncentraci, musí být použita následující metoda pro potvrzení.
1.3 Kvantitativní stanovení za přítomnosti donorů formaldehydu
Při použití výše uvedené metody (1.2) se při derivatizaci donory formaldehydu štěpí, což vede k příliš vysokým výsledkům (vázaný formaldehyd a formaldehyd v polymerní formě). Nejdříve se oddělí volný formaldehyd (vázaný nebo v polymerní formě) kapalinovou chromatografií.
2. DEFINICE
Obsah volného formaldehydu ve vzorku stanovený touto metodou se vyjádří v hmotnostních procentech.
3. KVALITATIVNÍ STANOVENÍ
3.1 Podstata metody
Volný a vázaný formaldehyd dává v prostředí kyseliny sírové za přítomnosti Schiffova činidla zbarvení růžové nebo do lila.
3.2 POUŽITÉ CHEMIKÁLIE
Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší a použije se demineralizovaná voda.
3.2.1 Fuchsin
3.2.2 Siřičitan sodný heptahydrát
3.2.3 Koncentrovaná kyselina chlorovodíková
3.2.4 Kyselina sírová, asi 1 mol/l
3.2.5 Schiffovo činidlo:
Do kádinky se naváží 100 mg fuchsinu (3.2.1) a rozpustí se v 75 ml vody o teplotě 80 °C. Po ochlazení se přidá 2,5 g siřičitanu sodného heptahydrátu (3.2.2) a 1,5 ml kyseliny chlorovodíkové (3.2.3). Objem se doplní do 100 ml.
Použitelnost do dvou týdnů.
3.3 Postup
3.3.1 Do kádinky na 10 ml se naváží 2 g vzorku.
3.3.2 Přidají se 2 kapky kyseliny sírové (3.2.4) a 2 ml Schiffova činidla (3.2.5). Toto činidlo musí být při použití naprosto bezbarvé.
Obsah se protřepe a nechá stát 5 minut.
3.2.3 Objeví-li se do 5 minut růžové zbarvení nebo barva lila, je přítomen formaldehyd v množství vyšším než 0,01 % a musí být stanoven volný a vázaný formaldehyd podle bodu 4. a v případě potřeby podle bodu 5.
4. OBECNÉ KOLORIMETRICKÉ STANOVENÍ FORMALDEHYDU POMOCÍ PENTAN-2,4-DIONU
4.1 Princip
Formaldehyd reaguje s pentan-2,4-dionem v přítomnosti octanu amonného za tvorby 3,5-diacetyl-1,4-dihydrolutidinu. Ten se extrahuje butan-1-olem a absorbance extraktu se měří při 410 nm.
4.2 POUŽITÉ CHEMIKÁLIE
Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší a použije se demineralizovaná voda.
4.2.1 Bezvodý octan amonný
4.2.2 Koncentrovaná kyselina octová,
4.2.3 Pentan-2,4-dion, čerstvě předestilovaný za sníženého tlaku 25 mm Hg při 25 °C – nesmí vykazovat žádnou absorpci při 410 nm
4.2.4 Butan-1-ol
4.2.5 Kyselina chlorovodíková, 1 mol/l
4.2.6 Kyselina chlorovodíková, asi 0,1 mol/l
4.2.7 Hydroxid sodný, 1 mol/l
4.2.8 Roztok škrobu, čerstvě připravený (1 g/50 ml vody) podle European Pharmacopoeia, 2. vydání 1980, část I-VI-1-1
4.2.9 37% až 40% (m/V) roztok formaldehydu
4.2.10 Odměrný roztok jodu, 0,05 mol/l
4.2.11 Odměrný roztok thiosíranu sodného, 0,1 mol/l
4.2.12 Činidlo obsahující pentan-2,4-dion:
V odměrné baňce na 1000 ml se rozpustí:
— 150 g octanu amonného (4.2.1),
— 2 ml pentan-2,4-dionu (4.2.3),
— 3 ml kyseliny octové (4.2.2).
Doplní se na 1000 ml vodou (pH roztoku asi 6,4).
Toto činidlo musí být připraveno čerstvě.
4.2.13 Činidlo (4.2.12) bez přídavku pentan-2,4-dionu
4.2.14 Standardní roztok formaldehydu: zásobní roztok
5 g roztoku formaldehydu (4.2.9) se převede do odměrné baňky na 1000 ml a doplní se vodou na 1000 ml.
Koncentrace tohoto roztoku se stanoví takto:
Odebere se 10,00 ml; přidá se 25,00 ml odměrného roztoku jodu (4.2.10) a 10,00 ml roztoku hydroxidu sodného (4.2.7).
Nechá se stát 5 minut.
Okyselí se 11,00 ml HCl (4.2.5) a přebytek jodu se titruje odměrným roztokem thiosíranu sodného (4.2.11), jako indikátor se použije roztok škrobu (4.2.8).
Spotřeba 1 ml 0,05 mol/l odměrného roztoku jodu (4.2.10) odpovídá 1,5 mg formaldehydu.
4.2.15 Standardní roztok formaldehydu: zředěný roztok
Zásobní roztok formaldehydu se zředí vodou nejprve v poměru 1/20 a poté v poměru 1/100. 1 ml výsledného roztoku obsahuje asi 1 μg formaldehydu.
Přesný obsah se vypočte.
4.3 Přístroje a pomůcky
4.3.1 Obvyklé laboratorní vybavení
4.3.2 Filtr pro separaci fází, Whatman 1 PS (nebo ekvivalentní)
4.3.3 Odstředivka
4.3.4 Vodní lázeň nastavená na teplotu 60 °C
4.3.5 Spektrofotometr
4.3.6 Skleněné kyvety s délkou optické dráhy 1 cm
4.4 Postup
4.4.1 Roztok vzorku
Do odměrné baňky na 100 ml se s přesností na 0,001 g naváží množství zkušebního vzorku (v g) odpovídající očekávanému obsahu formaldehydu asi 150 μg. Doplní se po rysku vodou a zamíchá se (roztok S). (Je nutno ověřit, zda je hodnota pH asi 6; v opačném případě se přidá roztok kyseliny chlorovodíkové (4.2.6).)
Do Erlenmeyerovy baňky na 50 ml se odměří
— 10,00 ml roztoku S,
— 5,00 ml činidla obsahujícího pentan-2,4-dion (4.2.12),
— doplní se demineralizovanou vodou na konečný objem 30 ml.
4.4.2 Standardní roztok
Možný rušivý vliv základního zbarvení zkušebního vzorku se odstraní použitím tohoto referenčního roztoku:
Do Erlenmeyerovy baňky na 50 ml se přidá
— 10,00 ml roztoku S,
— 5,00 ml činidla (4.2.13),
— demineralizovaná voda na konečný objem 30 ml.
4.4.3 Roztok pro slepý pokus
Do Erlenmeyerovy baňky na 50 ml se přidá:
— 5,00 ml činidla obsahujícího pentan-2,4-dion (4.2.12),
— demineralizovaná voda na konečný objem 30 ml.
4.4.4 Stanovení
Poznámka: Všechny tyto operace musí být provedeny do 25 minut od okamžiku, kdy byly Erlenmeyerovy baňky vloženy do lázně vyhřáté na 60 °C.
4.4.4.1 Směsi připravené podle bodů 4.4.1, 4.4.2 a 4.4.3 se protřepou. Erlenmeyerovy baňky se přesně na 10 minut vloží do vodní lázně vyhřáté na 60 °C. Nechají se vychladnout 2 minuty v lázni s ledovou vodou.
4.4.4.2 Obsah se převede do dělicí nálevky na 50 ml obsahující 10,00 ml butan-1-olu (4.2.4). Každá baňka se vypláchne 3 až 5 ml vody. Směs se přesně 30 sekund důkladně třepe. Fáze se nechají oddělit.
4.4.4.3 Obsah se přefiltruje do měřicích kyvet (4.3.2) přes filtr pro separaci fází. Fáze lze rovněž odstředit (při 3000 ot./min po dobu 5 minut).
4.4.4.4 Při 410 nm se změří absorbance (A1) extraktu roztoku vzorku (4.4.1) proti extraktu standardního roztoku (4.4.2).
4.4.4.5 Obdobně se změří absorbance (A2) extraktu roztoku slepého pokusu (4.4.3) proti butan-1-olu.
4.4.5 Kalibrační křivka
4.4.5.1 Do Erlenmeyerovy baňky na 50 ml se přidá:
— 5,00 ml zředěného standardního roztoku podle bodu 4.2.15,
— 5,00 ml činidla obsahujícího pentan-2,4-dion (4.2.12),
— demineralizovaná voda na celkový objem 30 ml.
4.4.5.2 Postupuje se tak, jak je popsáno v bodě 4.4.4, a měří se absorbance proti butan-1-olu (4.2.4).
4.4.5.3 Postup se opakuje s 10, 15, 20 a 25 ml zředěného standardního roztoku (4.2.15).
4.4.5.4 Nulová hodnota (odpovídající zabarvení reakčních činidel) se získá postupem podle bodu 4.4.4.5.
4.4.5.5 Po odečtení nulové hodnoty od každé hodnoty absorbance získané podle bodů 4.4.5.1 a 4.4.5.3 se sestrojí kalibrační křivka. Beerův zákon platí až do 30 μg formaldehydu.
4.5 Výpočty
4.5.1 Od hodnoty A1 se odečte hodnota A2 a z kalibrační křivky (4.4.5.5) se odečte množství C formaldehydu v roztoku vzorku (4.4.1) v μg.
4.5.2 Obsah formaldehydu ve vzorku (% m/m) se vypočte pomocí vzorce:
kde
m = je hmotnost zkušebního vzorku v g.
4.6 Opakovatelnost
Pro výrobky obsahující asi 0,2 % (m/m) formaldehydu nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,005 % pro kolorimetrickou metodu s pentan-2,4-dionem.
Vede-li kolorimetrické stanovení volného formaldehydu k výsledkům vyšším než je nejvyšší přípustná koncentrace podle vyhlášky Ministerstva zdravotnictví č. 26/2001 Sb., o hygienických požadavcích na kosmetické prostředky, o náležitostech žádosti o neuvedení ingredience na obalu kosmetického prostředku a o požadavcích na vzdělání a praxi fyzické osoby odpovědné za výrobu kosmetického prostředku a hodnocení bezpečnosti kosmetického prostředku pro zdraví fyzických osob (o kosmetických prostředcích), tj.
musí být použito postupu podle bodu 5.
a) 0,05 % až 0,2 % ve výrobku, u něhož není obsah formaldehydu uveden na etiketě,
b) více než 0,2 % ve výrobku s uvedením obsahu formaldehydu, nebo bez něho,
5. KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ ZA PŘÍTOMNOSTI DONORŮ FORMALDEHYDU
5.1 Princip
Oddělený formaldehyd se převede na žlutý derivát lutidinu reakcí s pentan-2,4-dionem v reaktoru za kolonou a absorbance vzniklého derivátu se měří při 420 nm.
5.2 POUŽITÉ CHEMIKÁLIE
Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší
5.2.1 Voda čistoty pro HPLC nebo voda ekvivalentní kvality
5.2.2 Bezvodý octan amonný
5.2.3 Koncentrovaná kyselina octová
5.2.4 Pentan-2,4-dion (uchovává se při 4 °C)
5.2.5 Bezvodý hydrogenfosforečnan sodný
5.2.6 Kyselina trihydrogenfosforečná, 85%
5.2.7 Methanol čistoty pro HPLC
5.2.8 Dichlormethan
5.2.9 Formaldehyd, 37% až 40% (m/V)
5.2.10 Hydroxid sodný, 1 mol/l
5.2.11 Kyselina chlorovodíková, 1 mol/l
5.2.12 Kyselina chlorovodíková, 0,002 mol/l
5.2.13 Roztok škrobu čerstvě připravený podle European Pharmacopoeia (viz 4.2.8)
5.2.14 Odměrný roztok jodu, 0,05 mol/l
5.2.15 Odměrný roztok thiosíranu sodného, 0,1 mol/l
5.2.16 Mobilní fáze:
Vodný roztok hydrogenfosforečnanu sodného (5.2.5), 0,006 mol/l, upravený na pH 2,1 kyselinou trihydrogenfosforečnou (5.2.6)
5.2.17 Činidlo do reaktoru za kolonou:
V odměrné baňce na 1000 ml se rozpustí:
— 62,5 g octanu amonného (5.2.2),
— 7,5 ml kyseliny octové (5.2.3),
— 5 ml pentan-2,4-dionu (5.2.4).
Objem se doplní po rysku vodou (5.2.1).
Roztok se uchovává ve tmě.
Skladovatelnost: nejvýše tři dny při 25 °C.
Barva roztoku by se neměla měnit.
5.2.18 Standardní roztok formaldehydu: zásobní roztok
10 g roztoku formaldehydu (5.2.9) se převede do odměrné baňky na 1000 ml a doplní se vodou na 1000 ml.
Koncentrace tohoto roztoku se stanoví takto:
Odebere se 5,00 ml; přidá se 25,00 ml odměrného roztoku jodu (5.2.14) a 10,00 ml roztoku hydroxidu sodného (5.2.10).
Nechá se stát 5 minut.
Okyselí se 11,00 ml HCl (5.2.11) a přebytek jodu se titruje odměrným roztokem thiosíranu sodného (5.2.15), jako indikátor se použije roztok škrobu (5.2.13).
Spotřeba 1 ml odměrného roztoku jodu (5.2.14) odpovídá 1,5 mg formaldehydu.
5.2.19 Standardní roztok formaldehydu: zředěný roztok
Zásobní roztok formaldehydu se zředí v poměru 1/100 mobilní fází (5.2.16). 1 ml výsledného roztoku obsahuje asi 37 μg formaldehydu. Přesný obsah se vypočte.
5.3 Přístroje a pomůcky
5.3.1 Obvyklé laboratorní vybavení
5.3.2 Bezpulzní čerpadlo pro HPLC
5.3.3 Nízkotlaké bezpulzní čerpadlo pro činidlo (případně druhé čerpadlo pro HPLC)
5.3.4 Nastřikovací ventil se smyčkou o objemu 10 μl
5.3.5 Reaktor za kolonou obsahující následující prvky:
+ jednolitrová tříhrdlá baňka,
+ jednolitrové topné hnízdo,
+ dvě kolony Vigreux o minimálně 10 patrech, vzduchem chlazené,
+ trubice z nerezové oceli (sloužící jako výměník tepla) 1,6 mm, vnitřní průměr 0,23 mm, délka 400 mm,
+ teflonová trubice 1,6 mm, vnitřní průměr 0,23 mm, délka 5 m (francouzské pletivo – viz příloha 1),
+ jeden díl ve tvaru T bez mrtvého objemu (Valco nebo ekvivalentní),
+ tři spojky bez mrtvého objemu,
nebo: jeden modul za kolonou Applied Biosystems PCRS 520 nebo ekvivalentní s reaktorem o objemu 1 ml.
5.3.6 Membránový filtr, velikost pórů 0,45 μm
5.3.7 Patrona SEP-PAK® C18 nebo ekvivalentní
5.3.8 Hotové kolony:
— Bischoff Hypersil RP 18 (typ NC číslo C 25.46 1805), (5 μm, délka 250 mm, vnitřní průměr 4,6 mm),
— nebo DuPont, Zorbax ODS (5 μm, délka 250 mm, vnitřní průměr 4,6 mm),
— nebo Phase SEP, spherisorb ODS 2 (5 μm, délka 250 mm, vnitřní průměr 4,6 mm).
5.3.9 Předkolona
Bischoff K1 hypersil RP 18 (typ K1 G 6301 1805) (5 μm, délka 10 mm) nebo ekvivalentní.
5.3.10 Kolona a předkolona se spojí systémem Ecotube (typ A 15020508 Bischoff) nebo ekvivalentním.
5.3.11 Aparatura (5.3.3) se sestaví podle blokového schématu v příloze 2.
Spoje za nastřikovacím ventilem musí být co nejkratší. V tomto případě má trubka z nerezové oceli mezi výstupem z reaktoru a vstupem do detektoru ochladit směs před detekcí; teplota detektoru není známa, ale je konstantní.
5.3.12 Detektor pro viditelnou a UV oblast
5.3.13 Zapisovač
5.3.14 Odstředivka
5.3.15 Ultrazvuková lázeň
5.3.16 Vibrační míchadlo (Vortex nebo ekvivalentní)
5.4 Postup
Poznámka: Celý chromatografický systém a systém za kolonou je nutno po použití propláchnout vodou (5.2.1). Nepoužije-li se systém do dvou dnů, musí po tomto proplachu následovat ještě propláchnutí methanolem (5.2.7). Před novým kondicionováním se systémem nechá protéci voda, aby se zabránilo rekrystalizaci.
5.4.1 Kalibrační křivka
Sestrojí se vynesením výšek píků jako funkce koncentrace zředěných formaldehydových kalibračních roztoků.
Kalibrační roztoky se připraví zředěním standardního roztoku formaldehydu (5.2.19) mobilní fází (5.2.16):
— 1,00 ml roztoku (5.2.19) se zředí na 20,00 ml (asi 185 μg/100 ml)
— 2,00 ml roztoku (5.2.19) se zředí na 20,00 ml (asi 370 μg/100 ml)
— 5,00 ml roztoku (5.2.19) se zředí na 25,00 ml (asi 740 μg/100 ml)
— 5,00 ml roztoku (5.2.19) se zředí na 20,00 ml (asi 925 μg/100 ml).
Kalibrační roztoky se ponechají asi jednu hodinu stát při pokojové teplotě a musí být čerstvě připraveny. Kalibrační křivka je lineární pro koncentrace od 1,00 do 15,00 μg/ml.
5.4.2 Příprava vzorků
5.4.2.1 Emulze (krémy, make-up, oční stíny)
Do odměrné baňky na 100 ml s uzávěrem se s přesností na 0,001 g naváží zkušební vzorek (m gramů) odpovídající očekávanému obsahu 100 μg formaldehydu. Přidá se přesně 20,00 ml dichlormethanu (5.2.8) a 20,00 ml kyseliny chlorovodíkové (5.2.12). Promíchá se pomocí vibračního míchadla (5.3.16) a v ultrazvukové lázni (5.3.15). Fáze se oddělí odstředěním (2 minuty při 3000 g). Mezitím se promyje patrona (5.3.7) 2 ml methanolu (5.2.7) a kondicionuje se 5 ml vody (5.2.1). Kondicionovanou patronou se nechají protéci 4 ml vodné fáze extraktu, první dva mililitry se odstraní a následující podíl se zachytí.
5.4.2.2 Pleťové lotiony, šampony
Do odměrné baňky na 100 ml s uzávěrem se s přesností na 0,001 g naváží zkušební vzorek (m gramů) odpovídající očekávanému obsahu 500 μg formaldehydu.
Doplní se po rysku mobilní fází (5.2.16).
Roztok se zfiltruje přes filtr (5.3.6) a nastříkne, nebo se nechá protéci patronou předem kondicionovanou podle bodu 5.4.2.1. Všechny roztoky musí být nastříknuty ihned po přípravě.
5.4.3 Chromatografické podmínky
— Průtok mobilní fáze: 1,0 ml/min,
— Průtok činidla: 0,5 ml/min,
— Celkový průtok na výstupu z detektoru: 1,5 ml/min,
— Objem nástřiku: 10 μl,
— Eluční teplota: u obtížných separací se kolona ponoří do ledové lázně a vyčká se do ustálení teploty (15 až 20 minut),
— Teplota reakce za kolonou: 100 °C,
— Detekce: při 420 nm.
5.5 Výpočet
Emulze: (5.4.2.1):
Obsah formaldehydu v % (m/m):
Pleťové lotiony a šampony:
V tomto případě platí vzorec:
kde
m = hmotnost analyzovaného vzorku v g (5.4.2.1),
C = koncentrace formaldehydu v μg/100 ml odečtená z kalibrační křivky (5.4.1).
5.6 Opakovatelnost
Pro výrobky obsahující asi 0,05 % (m/m) formaldehydu nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,001 %.
Pro výrobky obsahující asi 0,2 % (m/m) formaldehydu nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,005 %.
POKYNY PRO ZHOTOVENÍ „FRANCOUZSKÉHO PLETIVA“
NEZBYTNÉ PŘÍSLUŠENSTVÍ
— Dřevěná navíjecí cívka:
vnější průměr 5 cm s otvorem o průměru 1,5 cm uprostřed. Cívka se opatří čtyřmi ocelovými hřebíky (podle obrázků 7 a 8). Vzdálenost mezi dvěma hřebíky musí být 1,8 cm a musí být ve vzdálenosti 0,5 cm od středového otvoru;
— jedna pevná zahnutá jehla (háček) k protahování teflonové kapiláry;
— 5 m teflonové kapiláry o průměru 1,6 mm, vnitřního průměru 0,3 mm.
POSTUP:
Před zhotovením „francouzského pletiva“ musí být teflonová kapilára protažena středovým otvorem od horního konce cívky k dolnímu konci (asi 10 cm kapiláry se nechá vyčnívat z dolního konce cívky, což umožní protáhnout řetízek během pletení); poté se kapilára ovine kolem čtyř hřebíků, jak je znázorněno na obrázku 9.
Horní a dolní část pletiva bude chráněna kovovými kroužky a stahovacími šrouby; při utahování je třeba dbát na to, aby se teflon nepoškodil. Kapilára se podruhé ovine kolem každého hřebíku a následujícím způsobem se vytvoří „steh“:
— spodní část kapiláry se háčkem přetáhne přes horní část kapiláry (obrázek 10). Toto se postupně opakuje u každého hřebíku (1, 2, 3 a 4 proti směru hodinových ručiček), dokud se nezhotoví 5 m nebo požadovaná délka pletiva.
Je nutno ponechat asi 10 cm kapiláry k uzavření řetízku. Kapilára se provlékne každou ze čtyř smyček a lehce se utáhne tak, aby se řetízek uzavřel.
Poznámka: Francouzské pletivo pro reaktory za kolonou je komerčně dostupné (Supelco).
Obrázek 7
Schématické vyobrazení cívky
Obrázek 8
Obrázek 9
První řada
Obrázek 10
Druhá řada
„Steh“ se vytvoří tak, že se spodní kapilára (znázorněná plnou čarou) přetáhne přes druhou kapiláru (znázorněná čárkovaně)
Obrázek 11
| 1 | = čerpadlo pro HPLC |
| 2 | = nastřikovací ventil |
| 3 | = kolona s předkolonou |
| 4 | = čerpadlo pro činidla |
| 5 | = díl ve tvaru T bez mrtvého objemu |
| 5' | = díl ve tvaru T (Vortex) |
| 6 - 6' | = spojka bez mrtvého objemu |
| 7 | =„francouzské pletivo“ |
| 7 | = reaktor |
| 8 | = tříhrdlá baňka s vroucí vodou |
| 9 | = topné hnízdo |
| 10 | = chladič |
| 11 | = výměník tepla z nerezové trubky |
| 11' | = výměník tepla |
| 12 | = detektor pro viditelnou a UV oblast |
| 13 | = modul za kolonou PCRS 520 |