1. Vícenásobný PCR protokol s interní PCR kontrolou (Pastrik, 2000)
1.1. Oligonukleotidní primery
| primer PSA-1 | 5'- ctc ctt gtg ggg tgg gaa aa -3' |
| primer PSA-R | 5'- tac tga gat gtt tca ctt ccc c -3' |
| primer NS-7-F | 5'- gag gca ata aca ggt ctg tga tgc -3' |
| primer NS-8-R | 5'- tcc gca ggt tca cct acg ga -3' |
Předpokládaná velikost amplikonu z DNA C. m. subsp. sepedonicus šablony = 502 bp (sada PSA-primerů).
Předpokládaná velikost amplikonu z interní PCR kontroly 18S rRNA = 377 bp (sada NS- primerů).
1.2. Reakční směs PCR
| Činidlo | Množství na reakci | Konečná koncentrace |
|---|---|---|
| Sterilní voda (UPW) | 15,725 µl | |
| 10× PCR pufr (1) (15 mM MgCl2) | 2,5 µl | 1×(1,5 mM MgCl2) |
| BSA (frakce V) (10 %) | 0,25 µl | 0,1 % |
| Směs d-nTP (20 mM) | 0,125 µl | 0,1 mM |
| Primer PSA-1 (10 µM) | 0,5 µl | 0,2 µM |
| Primer PSA-R (10 µM) | 0,5 µl | 0,2 µM |
| Primer NS-7-F(10 µM) (2) | 0,1 µl | 0,04 µM |
| Primer NS-8-R (10 µM) (2) | 0,1 µl | 0,04 µM |
| Taq polymeráza (5 U/µl) (1) | 0,2 µl | 1,0 U |
| Vzorkové množství | 5,0 µl | |
| Celkový objem | 25,0 µl |
(1) Metody byly validovány za použití Taq polymerázy Perkin Elmer (AmpliTaq nebo Gold) a Gibco BRL.
(2) Koncentrace primerů NS-7 F a NS-8-R byla optimalizována pro extrakci pupkové části bramboru za použití homogenizační metody a purifikace DNA podle Pastrika (2000) (viz oddíl 6.1 písm. a) a 6.2). Při použití extrakce třepáním nebo jinými metodami izolace DNA je nutná nová optimalizace koncentrací činidla.
1.3. Reakční podmínky pro PCR
Postupuje se podle následujícího programu:
| 1 cyklus: | i) | 3 minuty při teplotě 95 °C (denaturace DNA matrice) |
| 10 cyklů | ii) | 1 minuta při teplotě 95 °C (denaturace DNA matrice) |
| iii) | 1 minuta při teplotě 64 °C (připojení primerů) | |
| iv) | 1 minuta při teplotě 72 °C (prodlužování kopie) | |
| 25 cyklů | v) | 30 sekund při teplotě 95 °C (denaturace DNA matrice) |
| vi) | 30 sekund při teplotě 62 °C (připojení primerů) | |
| vii) | 1 minuta při teplotě 72 °C (prodlužování kopie) | |
| 1 cyklus | viii) | 5 minut při teplotě 72 °C (závěrečná prodlužování) |
| ix) | Udržuje se při teplotě 4 °C |
Poznámka:
Tento program je optimalizován pro použití s tepelným cyklerem MJ Research PTC 200. Při použití jiných modelů může být nutná modifikace kroků cyklů ii), iii) iv), v), vi) a vii).
1.4. Analýzy ampliconu restriktivním enzymem
Produkty PCR amplifikované z DNA C. m. subsp. sepedonicus produkují charakteristickou mnohotvárnost délky fragmentu s enzymem Bgl II po inkubaci při teplotě 37 °C po dobu 30 minut. Fragmenty získané z fragmentu specifického pro C. m. subsp. sepedonicus mají rozměry 282 bp a 220 bp.