1.5 Popis metody

1.5.1 Příprava

1.5.1.1 Bakterie
Čerstvé bakteriální kultury se vypěstují do pozdního exponenciálního nebo počátečního stacionárního stadia růstu (zhruba 10⁹ buněk/ml). Kultury v pozdním stacionárním stadiu se nepoužívají. Důležité je, aby kultury použité pro experiment obsahovaly vysoký titr životaschopných bakterií. Titr se dá prokázat buď z historických údajů růstových křivek, nebo v jednotlivých testech stanovením počtu životaschopných buněk očkováním na miskách.
Doporučená inkubační teplota činí 37°C.
Použije se minimálně pět bakteriálních kmenů, které budou zahrnovat čtyři kmeny S. typhi murium (TA1535; TA1537 nebo TA97a nebo TA97; TA98; a TA100); u nichž byla prokázána spolehlivost a reprodukovatelnost výsledků mezi různými laboratořemi. Tyto čtyři kmeny S. typhi murium mají na primárním reverzním místě páry bází GC a je známo, že nemusejí detekovat určité oxidační mutageny, látky vyvolávající křížové vazby a hydraziny. Tyto látky se dají detekovat pomocí kmenů E. coli WP2 nebo S. typhi murium TA102,⁵) které mají na primárním reverzním místě pár bází AT. Proto je doporučená kombinace kmenů tato:
- S. typhi murium TA1535,
- S. typhi murium TA1537 nebo TA97 nebo TA97a,
- S. typhi murium TA98,
- S. typhi murium TA100 a
- E. coli WP2 uvrA nebo E. coli WP2 uvrA (pKM101) nebo S. typhi murium TA102.
K detekci mutagenů vytvářejících křížové vazby může být nejvhodnější použít TA102 nebo přidat DNA reparačně proficientní kmen E. coli (např. E. coli WP2 nebo E. coli WP2 (pKM101)).
Je třeba použít zavedených postupů přípravy zásobní kultury, ověření markeru a uchovávání. Pro každý zmrazený preparát zásobní kultury je třeba prokázat závislost na aminokyselině nutné pro růst (histidin v případě kmenů S. typhi murium, tryptofan v případě kmenů E. coli). Podobně je třeba zkontrolovat i další fenotypické charakteristiky, a to: přítomnost či nepřítomnost R-faktor plazmidů tam, kde to přichází v úvahu (např. rezistence vůči ampicilinu u kmenů TA98, TA100 a TA97a nebo TA97, WP2 uvrA (pKM101) a rezistence vůči ampicilinu + tetracyklinu u kmene TA 102); přítomnost charakteristických mutací (tj. rfa mutace u S. typhimurium pomocí citlivosti vůči krystalové violeti a uvrA mutace u E. coli nebo uvrB mutace u S. typhimurium pomocí citlivosti na ultrafialové záření).⁵) Použité kmeny mají mít počet spontánně revertujících kolonií ve frekvenčním rozmezí očekávaném podle historických kontrolních dat dané laboratoře a pokud možno i v rozmezí uvedeném v literatuře.

1.5.1.2 Médium
Použije se vhodný minimální agar (např. s Vogelovým-Bonnerovým minimálním médiem E a glukózou) a vrchní agar obsahující histidin a biotin nebo tryptofan umožňující několik dělení buněk.⁵)

1.5.1.3 Metabolická aktivace
Bakterie se působení testované látky vystaví jak za přítomnosti, tak za nepřítomnosti vhodného systému metabolické aktivace. Nejčastěji se používá kofaktorem suplementovaná post-mitochondriální frakce (S9) připravená z jater hlodavců po indukci enzymů látkami jako je Aroclor 1254⁵) nebo kombinace fenobarbitalu a β-naftoflavonu.⁵) Post-mitochondriální frakce se obvykle používá v koncentracích mezi 5 a 30 % v/v ve směsi S9. Volba a podmínky metabolického aktivačního systému mohou záviset na třídě testované chemikálie. V některých případech může být vhodné použít post-mitochondriální frakci v několika koncentracích. U azobarviv a diazosloučenin může být vhodnější použít redukční systém metabolické aktivace.⁵)

1.5.1.4 Testovaná látka / příprava
Pevné látky se před působením na bakterie rozpustí nebo se připraví jejich suspenze ve vhodném rozpouštědle nebo vehikulu a případně se zředí. Kapalné látky se mohou do pokusného systému přidávat přímo nebo se předtím ředí. Je třeba používat čerstvé preparáty, ledaže údaje o stabilitě prokazují, že jejich delší skladování je přijatelné.

1.5.2 Podmínky testu

1.5.2.1 Pokusné kmeny (viz 1.5.1.1)

1.5.2.2 Koncentrace
Ke kritériím, která je třeba vzít v úvahu při stanovení nejvyššího použitého množství testované látky, patří cytotoxicita a rozpustnost v konečné směsi, která se k působení použije.
Může být účelné stanovit toxicitu a nerozpustnost v předběžném experimentu. Cytotoxicita se dá zjistit snížením počtu revertantních kolonií, vymizením nebo zmenšením růstu na pozadí nebo pomocí stupně přežití pokusných kultur. Za přítomnosti metabolického aktivačního systému se může cytotoxicita změnit. Nerozpustnost se posuzuje podle srážení v konečné směsi za skutečných pokusných podmínek, viditelného i pouhým okem.
Doporučená maximální pokusná koncentrace je u rozpustných necytotoxických látek 5 mg/misku resp. 5 μl/misku. U necytotoxických látek, jež v těchto koncentracích nejsou rozpustné, by jedna nebo několik koncentrací mělo být v konečné pokusné směsi nerozpustných. Testované látky, jež jsou cytotoxické již za koncentrací nižších než 5 mg/misku resp. 5 μl/misku, se testují až do cytotoxické koncentrace. Sraženina nesmí rušit při vyhodnocování.
Používá se minimálně pěti různých analyzovatelných koncentrací se zhruba půl-logaritmickým intervalem (tj. √10) mezi jednotlivými body v prvotním experimentu. Zkoumá-li se koncentrační závislost, může být vhodný interval menší. Testování za koncentrací vyšších než 5 mg/misku resp. 5 μl/ misku přichází v úvahu, hodnotí.li se látka obsahující podstatné množství potenciálně mutagenních nečistot.

1.5.2.3 Negativní a pozitivní kontroly
Každý test musí zahrnovat i souběžnou kmenově specifickou pozitivní a negativní (rozpouštědlo nebo vehikulum) kontrolu, jak s metabolickou aktivací, tak bez ní. Pro pozitivní kontrolu se volí takové koncentrace, jež prokazují efektivnost daného testu.
U testů s metabolickým aktivačním systémem se referenční látka pro pozitivní kontrolu volí podle použitého typu bakteriálního kmene.
Příklady látek, jež jsou vhodné pro pozitivní kontrolu v testech s metabolickou aktivací, uvádí tabulka:

Látka	CAS	EINECS
9,10-dimethylantracen	781-43-1	212-308-4
7,12-dimethylbenz[a] antracen	57-97-6	200-359-5
benz[a]pyren	50-32-8	200-028-5
2-aminoantracen	613-13-8	210-330-9
cyklofosfamid monohydrát cyklofosfamidu	50-18-0 6055-19-2	200-015-4

Následující látka je vhodnou pozitivní kontrolou při použití metabolické aktivace reduktázami:

Látka	CAS	EINECS
Kongo červeň	573-58-0	209-358-4

2-aminoantracen se nepoužívá jako jediný indikátor účinnosti směsi S9. Pokud se 2-aminoantracen použije, je třeba každou šarži S9 charakterizovat také mutagenem, který vyžaduje metabolickou aktivaci mikrosomálními enzymy, např. benz[a]pyrenem, dimethylbenzantracenem.
Příklady látek, jež jsou vhodné pro kmenově specifickou pozitivní kontrolu v testech bez exogenního systému metabolické aktivace, uvádí tato tabulka:

Látka	CAS	EINECS
azid sodný	26628-22-8	247-852-1	TA 1535 a TA 100
2-nitrofluoren	607-57-8	210-138-5	TA 98
9-aminoakridin	90-45-9	201-995-6	TA 1537, TA 97 a TA 97a
ICR 191	17070-45-0	241-129-4	TA 1537, TA 97 a TA 97a
kumen-hydroperoxid	80-15-9	201-254-7	TA 102
mitomycin C	50-07-7	200-008-6	WP2 uvrA a TA 102
N-ethyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin	70-25-7	200-730-1	WP2, WP2uvrA a WP2uvrA(pKM101)
4-nitrochinolin-1-oxid	56-57-5	200-281-1	WP2, WP2uvrA a WP2uvrA(pKM101)
urylfuramid (AF2)	3688-53-7		kmeny obsahující plazmidy

K pozitivní kontrole lze použít i jiné vhodné referenční látky. Jsou-li dostupné, je třeba uvážit použití chemikálií se vztahem k chemické třídě.
Je třeba použít i negativní kontroly sestávající z rozpouštědla nebo vehikula samotného, bez testované látky, se kterými se jinak zachází stejně jako při použití testované látky. Mimoto se použijí i negativní kontroly bez ovlivnění testovanou látkou, ledaže existují historické kontrolní údaje prokazující, že zvolené rozpouštědlo nevyvolává žádné rušivé či mutagenní účinky.

1.5.3 Postup
Při klasické miskové metodě⁵) bez metabolické aktivace se obvykle smísí 0,05 nebo 0,1 ml testovaného roztoku, 0,1 ml čerstvé bakteriální kultury (obsahující zhruba 10⁸ životaschopných buněk) a 0,5 ml sterilního pufru a 2,0 ml vrchního agaru. V testech s metabolickou aktivací se obvykle mísí 0,5 ml metabolické aktivační směsi obsahující přiměřené množství post-mitochondriální frakce (v rozmezí 5 – 30 % v/v v metabolické aktivační směsi) s 2,0 ml vrchního agaru společně s bakteriemi a testovanou látkou /testovaným roztokem. Obsah každé zkumavky se promísí a nalije na povrch misky s minimálním agarem. Vrchní agar se nechá před inkubací ztuhnout.
Při preinkubační metodě⁵) se testovaná látka / testovaný roztok nechá preinkubovat s pokusným kmenem (obsahujícím zhruba 10⁸ životaschopných buněk) a sterilním pufrem nebo metabolickým aktivačním systémem (0,5 ml) obvykle po dobu 20 min nebo déle při 30 – 37 °C; potom se smísí s vrchním agarem a nalije na misku s minimálním agarem. Obvykle se mísí 0,05 nebo 0,1 ml testované látky / testovaného roztoku, 0,1 ml bakterií a 0,5 ml směsi S9 nebo sterilního pufru s 2,0 ml vrchního agaru. Zkumavky se během preinkubace provzdušňují třepáním.
Pro adekvátní odhad variací se pro každou dávku očkují tři misky. Duplicitní očkování je přijatelné, je-li vědecky zdůvodněno. Dojde-li náhodně ke ztrátě misky, nemusí to test nutně znehodnotit.
Plynné nebo těkavé látky se testují za použití vhodných postupů, například v zatavených nádobách.⁵)

1.5.4 Inkubace
Všechny misky v rámci daného testu se inkubují při teplotě 37 °C po dobu 48 – 72 hodin, načež se spočítají revertantní kolonie na každé misce.