1.5.2 Podmínky testu

1.5.2.1 Pokusné kmeny (viz 1.5.1.1)

1.5.2.2 Koncentrace
Ke kritériím, která je třeba vzít v úvahu při stanovení nejvyššího použitého množství testované látky, patří cytotoxicita a rozpustnost v konečné směsi, která se k působení použije.
Může být účelné stanovit toxicitu a nerozpustnost v předběžném experimentu. Cytotoxicita se dá zjistit snížením počtu revertantních kolonií, vymizením nebo zmenšením růstu na pozadí nebo pomocí stupně přežití pokusných kultur. Za přítomnosti metabolického aktivačního systému se může cytotoxicita změnit. Nerozpustnost se posuzuje podle srážení v konečné směsi za skutečných pokusných podmínek, viditelného i pouhým okem.
Doporučená maximální pokusná koncentrace je u rozpustných necytotoxických látek 5 mg/misku resp. 5 μl/misku. U necytotoxických látek, jež v těchto koncentracích nejsou rozpustné, by jedna nebo několik koncentrací mělo být v konečné pokusné směsi nerozpustných. Testované látky, jež jsou cytotoxické již za koncentrací nižších než 5 mg/misku resp. 5 μl/misku, se testují až do cytotoxické koncentrace. Sraženina nesmí rušit při vyhodnocování.
Používá se minimálně pěti různých analyzovatelných koncentrací se zhruba půl-logaritmickým intervalem (tj. √10) mezi jednotlivými body v prvotním experimentu. Zkoumá-li se koncentrační závislost, může být vhodný interval menší. Testování za koncentrací vyšších než 5 mg/misku resp. 5 μl/ misku přichází v úvahu, hodnotí.li se látka obsahující podstatné množství potenciálně mutagenních nečistot.

1.5.2.3 Negativní a pozitivní kontroly
Každý test musí zahrnovat i souběžnou kmenově specifickou pozitivní a negativní (rozpouštědlo nebo vehikulum) kontrolu, jak s metabolickou aktivací, tak bez ní. Pro pozitivní kontrolu se volí takové koncentrace, jež prokazují efektivnost daného testu.
U testů s metabolickým aktivačním systémem se referenční látka pro pozitivní kontrolu volí podle použitého typu bakteriálního kmene.
Příklady látek, jež jsou vhodné pro pozitivní kontrolu v testech s metabolickou aktivací, uvádí tabulka:

Látka	CAS	EINECS
9,10-dimethylantracen	781-43-1	212-308-4
7,12-dimethylbenz[a] antracen	57-97-6	200-359-5
benz[a]pyren	50-32-8	200-028-5
2-aminoantracen	613-13-8	210-330-9
cyklofosfamid monohydrát cyklofosfamidu	50-18-0 6055-19-2	200-015-4

Následující látka je vhodnou pozitivní kontrolou při použití metabolické aktivace reduktázami:

Látka	CAS	EINECS
Kongo červeň	573-58-0	209-358-4

2-aminoantracen se nepoužívá jako jediný indikátor účinnosti směsi S9. Pokud se 2-aminoantracen použije, je třeba každou šarži S9 charakterizovat také mutagenem, který vyžaduje metabolickou aktivaci mikrosomálními enzymy, např. benz[a]pyrenem, dimethylbenzantracenem.
Příklady látek, jež jsou vhodné pro kmenově specifickou pozitivní kontrolu v testech bez exogenního systému metabolické aktivace, uvádí tato tabulka:

Látka	CAS	EINECS
azid sodný	26628-22-8	247-852-1	TA 1535 a TA 100
2-nitrofluoren	607-57-8	210-138-5	TA 98
9-aminoakridin	90-45-9	201-995-6	TA 1537, TA 97 a TA 97a
ICR 191	17070-45-0	241-129-4	TA 1537, TA 97 a TA 97a
kumen-hydroperoxid	80-15-9	201-254-7	TA 102
mitomycin C	50-07-7	200-008-6	WP2 uvrA a TA 102
N-ethyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin	70-25-7	200-730-1	WP2, WP2uvrA a WP2uvrA(pKM101)
4-nitrochinolin-1-oxid	56-57-5	200-281-1	WP2, WP2uvrA a WP2uvrA(pKM101)
urylfuramid (AF2)	3688-53-7		kmeny obsahující plazmidy

K pozitivní kontrole lze použít i jiné vhodné referenční látky. Jsou-li dostupné, je třeba uvážit použití chemikálií se vztahem k chemické třídě.
Je třeba použít i negativní kontroly sestávající z rozpouštědla nebo vehikula samotného, bez testované látky, se kterými se jinak zachází stejně jako při použití testované látky. Mimoto se použijí i negativní kontroly bez ovlivnění testovanou látkou, ledaže existují historické kontrolní údaje prokazující, že zvolené rozpouštědlo nevyvolává žádné rušivé či mutagenní účinky.