1. Použití postupových diagramů

1.1. Postupový diagram pro diagnózu hnědé hniloby a bakteriálního vadnutí (Ralstonia solanacearum) hlíz bramboru a rostlin bramboru, rajčete a jiných hostitelských rostlin vykazujících příznaky hnědé hniloby nebo bakteriálního vadnutí
Postup testování je určen pro hlízy a rostliny bramboru s podezřením z výskytu nebo typickými příznaky hnědé hniloby nebo bakteriálního vadnutí. Zahrnuje rychlý screeningový test, izolaci patogena z infikovaného vodivého pletiva na selektivní živné půdě a v případě pozitivního výsledku identifikaci kultury Ralstonia solanacearum.

1) Popis příznaků se nachází v oddíle 2.1.
2) Rychlé diagnostické testy usnadňují předběžnou diagnózu, ale nejsou dokonalé. Negativní výsledek naznačuje vždy nepřítomnost patogenu.
3) Test na výtok slizu ze svazků cévních stonku je popsán v oddíle 6.1.1.
4) Test na přítomnost granulí poly-β-hydroxybutyrátu je popsán v oddíle 6.1.2.
5) Sérologické aglutinační testy bakteriálního slizu nebo extraktů z pletiva vykazujícího příznaky jsou popsány v oddíle 6.1.3.
6) Test IF bakteriálního slizu suspendovaného ve vodě nebo extraktech pletiva vykazujícího příznaky je popsán v oddíle 6.1.5.
7) Test FISH bakteriálního slizu suspendovaného ve vodě nebo extraktech pletiva vykazujícího příznaky je popsán v oddíle 6.1.7.
8) Test ELISA bakteriálního slizu suspendovaného ve vodě nebo extraktech pletiva vykazujícího příznaky je popsán v oddíle 6.1.8.
9) Test PCR bakteriálního slizu suspendovaného ve vodě nebo extraktech pletiva vykazujícího příznaky je popsán v oddíle 6.1.6.
10) Patogen je obvykle snadno izolovatelný z rostlinného materiálu vykazujícího příznaky metodou zřeďovacích roztěrů (postupným ředěním) (viz. v oddíle 2.3.).
11) Typická morfologie kolonie je popsána v oddíle 2.3.d.
12) Kultivace může selhat při pokročilých fázích infekce z důvodů konkurence nebo bujného růstu saprofytických bakterií. Jestliže jsou příznaky infekce typické, ale izolační test je negativní, musí se izolace opakovat, nejlépe kultivací na selektivních živných půdách.
13) Spolehlivá identifikace čistých kultur R. solanacearum se provede pomocí testů popsaných v bodu 6.2. Dílčí specifická charakteristika je nepovinná, ale doporučuje se pro každý nový případ.
14) Test patogenity je popsán v bodu 6.3.

1.2. Postupový diagram pro detekci a identifikaci Ralstonia solanacearum ve vzorcích hlíz bramboru nevykazujících příznaky
Testování je určeno ke zjištění latentních infekcí v hlízách bramboru. Pozitivní výsledek alespoň ze dvou screeningových testů (viz poznámka v diagramu 3), z nichž každý je založen na jiném biologickém principu, musí být doplněn izolací patogenu a dále, v případě izolace typických kolonií, potvrzením, že čistá kultura je R. solanacearum. Pozitivní výsledek pouze z jednoho screeningového testu není dostačující k tomu, aby byl vzorek považován za podezřelý. Screeningové testy a izolační testy musí umožnit detekční práh 10³ až 10⁴ buněk/ml resuspendované pelety zahrnutý jako pozitivní kontroly v každé sérii testů.

1) Standardní velikost vzorku je 200 hlíz, ačkoli postup lze použit i na menší počet, jestliže 200 hlíz není k dispozici.
2) Metody extrakce a koncentrace patogenu jsou popsány v oddíle 3.1.1.
3) Pokud jsou alespoň dva testy založené na různých biologických principech pozitivní, musí být provedena izolace a potvrzení. Provede se nejméně jeden screeningový test. Je-li test negativní, je vzorek považován za negativní. V případě, že je test pozitivní, je pro validaci prvního pozitivního výsledku nezbytný ještě jeden nebo více screeningových testů založených na různých biologických principech. Je-li druhý nebo další test negativní, je vzorek považován za negativní. Další testy nejsou nutné.
4) Test IF je popsán v oddíle 6.1.5.
5) Test selektivní izolace je popsán v oddíle 6.1.4.
6) Testy PCR jsou popsány v oddíle 6.1.6.
7) Test FISH je popsán v oddíle 6.1.7.
8) Testy ELISA jsou posány v oddíle 6.1.8.
9) Biotest je popsán v oddíle 6.1.9.
10) Typická morfologie kolonie je popsána v oddíle 2.3.d.
11) Kultivace nebo biotest mohou selhat z důvodů konkurence nebo inhibice saprofytickými bakteriemi. Jsou-li ve screeningových testech získány pozitivní výsledky, ale izolační testy jsou negativní, je třeba opakovat izolační testy ze stejné pelety nebo dodatečným odebráním vodivého pletiva z blízkosti pupkového konce hlíz stejného vzorku, případně provést test s dalšími vzorky.
12) Spolehlivé identifikace čistých kultur podezřelých na R. solanacearum se dosáhne pomocí testů popsaných v oddíle 6.2.
13) Test patogenity je popsán v oddíle 6.3.
Postupový diagram pro detekci a identifikaci Ralstonia solanacearum ve vzorcích rostlin bramboru nevykazujících příznaky, rostlin rajčete nevykazujících příznaky nebo rostlin jiných hostitelských rostlin nevykazujících příznaky

1) Viz. oddíl 3.2.1., kde jsou uvedeny doporučené velikosti vzorků.
2) Metody extrakce a koncentrace patogenu jsou popsány v oddíle 3.2.1.
3) Pokud jsou alespoň dva testy založené na různých biologických principech pozitivní, musí být provedena izolace a potvrzení. Provede se alespoň jeden screeningový test. Je-li test negativní, je vzorek považován za negativní. V případě, že je test pozitivní, vyžaduje se pro validaci prvního pozitivního výsledku provedení druhého nebo více screeningových testů založených na různých biologických principech. Jsou-li druhý nebo další testy negativní, považuje se vzorek za negativní. Další testy nejsou nutné.
4) Selektivní izolační test je popsán v oddíle 6.1.4.
5) Test IF je popsán v oddíle 6.1.5.
6) Testy PCR jsou popsány v oddíle 6.1.6.
7) Test FISH je popsán v oddíle 6.1.7.
8) Testy ELISA jsou popsány v oddíle 6.1.8.
9) Biotest je popsán v oddíle 6.1.9.
10) Typická morfologie kolonie je popsána v oddíle 2.3.d.
11) Kultivace nebo biotest mohou selhat z důvodů konkurence nebo inhibice saprofytickými bakteriemi. Jsou-li ve screeningových testech získány pozitivní výsledky, ale izolační testy jsou negativní, opakují se izolační testy.
12) Spolehlivé identifikace čistých kultur, u kterých je podezření, že se jedná o R. solanacearum, se dosáhne pomocí testů popsaných v oddíle 6.2.
13) Test patogenity je popsán v oddíle 6.3.